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脂联素(adiponectin)是脂肪细胞特异分泌的血浆蛋白,它与胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等密切相关,检测adiponectin在血中的含量是研究其生理学功能及调控的手段之一,对于预测某些疾病的发生、发展有一定的意义。另外,由于adiponectin的活性主要集中在其球状区(gadiponectin),而可溶蛋白又较包涵体有可能形成正确的折叠,从而具有一定的生物学活性,所以对adiponectin及gadiponectin的可溶表达将为其功能和作用机制的研究奠定基础,同时还能进一步制备ELISA检测所需的针对不同抗原表位的单、多克隆抗体。目前,国外检测人血adiponectin含量的方法主要有ELISA及RIA两种,其中ELISA大多采用生物素-亲和素信号放大系统,操作相对烦琐,检测周期较长,而国内尚无此类成套试剂。 目的:我们试图建立一简便、快捷的检测人血中adiponectin含量的ELISA方法,检测Ⅱ型糖尿病患者及健康体检者血中adiponectin的变化;并试图克隆表达有生物学活性的adiponectin及gadiponectin蛋白,并制备多克隆抗体,以利下一步进一步优化相关检测方法。 方法:用纯化的大肠杆菌重组表达包涵体adiponectin,免疫家兔和Balb/C小鼠分别制备多克隆和单克隆抗人adiponectin抗体,纯化后,用单抗包被微孔板,多抗标上辣根过氧化物酶,同时制备了一种新型血清或血浆样品稀释液,双抗体夹心法检测adiponectin,绘制标准曲线,检测Ⅱ型糖尿病和健康体检者血标本中adiponectin的含量,并进行统计学分析。为在此基础上进一步优化检测方法,我们以pQE30-adiponectin质粒为模板,PCR分别扩增adiponectin及gadiponectin DNA,并插入pGEX-4T-2表达载体,转化入BL21大肠杆菌,在25℃使用IPTG诱导,进行可溶性表达。可溶表达的蛋白经GSTrap柱亲和纯化后免疫家兔,制备多抗,利用Western blot鉴定多抗与人血清中adiponectin的反应性。使用肝癌细胞和外周血单个核细胞对可溶表达蛋白进行体外生物学活性鉴定。 结果:我们建立的ELISA系统的灵敏度为0.5μg/ml,板内、板间的精密度<8%。血清检测线性关系较好,准确性在88%-108%。新研制的血清或血浆