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研究目的骨髓异常增生综合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)是造血干细胞的恶性克隆性疾病,特点为无效造血、难治性血细胞减少,高危MDS会向急性髓系白血病转化。目前常根据国际预后评分系统(IPSS)来预测MDS向白血病转化的风险,将MDS分为较低危(多为RCUD,RCMD)和较高危(多为RAEB)状态。伴有原始细胞增多的高危患者,向白血病转化的发生率高,常规化疗效果差,缓解期短,易发生耐药,一直是临床面临的难题。阿糖胞苷(Ara-C)作为嘧啶类抗代谢药物,通过抑制细胞DNA的合成,干扰细胞的增殖,是治疗高危MDS病人的传统药物。然而,MDS病人对阿糖胞苷的单药治疗的总反应率只有20%-30%。有文献报道,NRF2与急性髓系白血病(AML),慢性髓系白血病(CML)和慢性淋系白血病(CLL)耐药有关。在化学/氧化应激条件下,细胞中NRF2可逃离KEAP1的抑制,通过NRF2上Neh1域的一个核转位信号进入胞核,启动抗氧化反应元件(ARE)调节的靶基因的转录。NRF2的靶基因有:醌氧化还原酶-1(NQO1),血红素加氧酶(HO-1)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶(GCL)等等。以上NRF2的靶基因能够保护细胞应对各种有毒物质引起的应激。目前仍未知NRF2是否能提示MDS患者的临床预后,或者NRF2是否与MDS患者耐药相关。研究方法1)对已发表的MDS患者的基因表达数据进行基因富集分析,并在MDS患者骨髓标本中进行免疫组化实验,以探究MDS患者NRF2的表达情况,以及其对预后的影响。免疫组化染色评分采用积分半定量法。2)体外实验以高危MDS细胞株SKM-1以及MDS小鼠模型细胞株Ml1PTD/WT/RUNX1-S291fs为主要研究对象,研究NRF2在MDS中的耐药作用。利用慢病毒转染,构建NRF2以及DUSP1 shRNA的细胞株,并利用Western blot和Q-PCR验证敲低是否成功;利用MTS、台酚蓝染色计数检测MDS细胞活性和增殖情况,描绘细胞生长曲线和存活率曲线;通过流式细胞术检测细胞凋亡和周期;通过尾静脉注射NRF2 shRNA和scramble shRNA SKM-1细胞至NOD/SCID-IL2Rynull-SGM3(NSGS)小鼠,构建MDS移植小鼠模型,进行后续体内实验。染色质免疫沉淀技术及Q-PCR验证NRF2及DUSP1的关系。研究结果1)NRF2在高危MDS中表达升高,并与不良预后相关183例MDS患者的基因富集分析结果提示:与较低危MDS(RARS和RA)患者相关,NRF2下游靶基因在较高危MDS患者(REAB-1/2)中显著富集(P=0.020)。137例MDS患者的骨髓免疫组化结果提示,高危的MDS患者(IPSS-R评分为极高危、高危和中危)骨髓中NRF2的表达高于低危患者(IPSS-R评分为低危)(P=0.010)。预后生存分析结果显示,NRF2表达水平较高的患者(IHC评分为4～6)总生存期(OS)比NRF2表达水平较低的患者(IHC评分为0～3)较短(中位生存期,391 天比 554 天,P=0.011)。2)敲低NRF2使MDS细胞系对阿糖胞苷的敏感性增加NRF2抑制剂木犀草素(Luteolin)与阿糖胞苷同时处理MDS细胞后可降低阿糖胞苷的IC50。而NRF2激动剂莱菔硫烷(Sulforaphane)可使MDS细胞对阿糖胞苷耐药。NRF2shRNA慢病毒转染MDS细胞可显著降低细胞NRF2的表达水平。较高浓度阿糖胞苷处理时,NRF2 shRNA细胞的早期和晚期凋亡较scramble shRNA细胞显著增加,同时更倾向于S期阻滞。3)NRF2通过其下游靶基因DUSP1调节MDS细胞对阿糖胞苷的耐药我们分析了公开数据库里的对阿糖胞苷敏感(IC50<6 μM)和耐药(IC50>80μM)的AML病人(共10例)的基因表达情况。发现有37个NRF2下游靶基因既在高危MDS病人中过表达,也在阿糖胞苷耐药的AML病人中过表达。染色质免疫沉淀技术及q-PCR进一步验证DUSP1是NRF2的下游靶基因。DUSP1的抑制剂BCI与阿糖胞苷在MDS细胞中有协同抑制作用。DUSP1的敲低能够逆转高NRF2引起的阿糖胞苷耐药。以上结果提示,NRF2下游靶基因DUSP1是MDS细胞对阿糖胞苷耐药的机制之一。在骨髓移植小鼠中,NRF2敲低的MDS小鼠肝脏肿瘤显著减小(PBS处理组,2.30 g;阿糖胞苷处理组,1.77 g;P=0.010),DUSP1敲低的MDS小鼠肝脏肿瘤亦显著减小(PBS处理组,1.84 g;阿糖胞苷处理组,1.41 g;P=0.001)。而在对照组小鼠中,肝脏肿瘤有减小的趋势,但无显著性差异(PBS处理组,1.91g;阿糖胞苷处理组,1.53g;P=0.052)。研究结论本文较系统地讨论了 NRF2对MDS细胞阿糖胞苷耐药的影响,并对其分子机制进行了初步探讨。研究表明,NRF2表达水平在高危MDS患者中升高,并且提示不良预后。高NRF2表达水平的患者预后更差。NRF2抑制剂能使MDS细胞对阿糖胞苷反应性增加,而NRF2激动剂使其对阿糖胞苷耐药。NRF2可通过下游基因DUSP1在MDS中调节耐药作用。本研究显示,敲低NRF2使MDS细胞对阿糖胞苷敏感;NRF2-DUSP1靶向治疗与传统化疗的结合为将来高危MDS的治疗带来新希望。