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主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)是一组紧密连锁的基因群,具有多态性,其在脊椎动物的移植排斥反应、免疫应答以及免疫调节等方面起重要作用。MHC主要分为MHC Ⅰ和MHC ⅡI类分子。恒定链(Invariant chain,Ii)是MHC Ⅱ类分子的伴侣蛋白,属于Ⅱ型跨膜糖蛋白。研究表明Ii能够与MHC Ⅱ类分子结合,协助外源性抗原肽的递呈,在此过程中,Ii的CLIP(Class Ⅱ-associated invariant chain peptide)起关键作用。Ii还能与MHC Ⅰ类分子结合,参与内源性抗原肽。迄今为止,关于鱼类的Ii和CLIP与MHC类分子的结合特征报道极少。为了解草鱼Ii和CLIP与MHC分子在结合过程中的关系,并进一步探明Ii在抗原呈递过程中的作用,本论文主要进行了以下几方面研究。首先,构建重组质粒和蛋白的表达纯化。根据GenBank登陆的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)Mhc Ⅰα、Mhc Ⅰβ、Mhc Ⅱα、Mhc Ⅱβ和Ii基因序列设计引物,以实验室保存的Mhc Ⅰa、Mhc Ⅰβ、MhcⅡα、Mhc Ⅱβ和Ii的基因为模板,克隆并纯化得到相应目的基因,分别插入原核表达载体上构建相应的原核表达重组质粒。然后将重组质粒分别转化大肠杆菌Rosetta(DE3)获得相应的重组菌。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达相应蛋白,结果表明这些目的基因均可以正确表达相应的目的蛋白。依据载体的标签选择对应的层析柱进行蛋白的纯化,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示获得较纯的目的蛋白。其次,进行MHC与Ii和CLIP分子间结合特性的研究。用Pull-down技术检测关联蛋白间结合活性,Western-blot结果显示草鱼MHC分子的Ⅰα、Ⅱα、Ⅱβ能够与Ii或CLIP在体外结合,而不与Iβ结合;CLIP和Ii竞争性结合MHC分子结果显示Ii和CLIP能够共同结合MHC分子的Ⅰα、Ⅱα和Ⅱβ,却不结合Ⅰβ;MHC分子和Ii或CLIP的竞争性Pull-down试验结果显示CLIP和Ii均能够与MHC分子结合形成三聚体结构。最后,在细胞内研究MHC分子与Ii和CLIP的定位和结合。将克隆出基因插入到真核表达载体βEGFP-N1和βmCherry-N1上,得到相应的真核重组质粒后共转染到293T细胞中,通过激光共聚焦显微镜观察其在真核细胞中的分子之间的共定位,结果显示Ii能够在细胞内与MHC分子四条链共定位,而CLIP只能与MHC分子部分定位;重组质粒与细胞器的共定位结果显示Ii能够与细胞膜、内体、内质网和高尔基体共定位,而CLIP只能与高尔基体部分定位;免疫共沉淀验证Ii或CLIP与MHC分子在细胞内的相互作用,结果显示Ii和CLIP均能够与MHC分子产生共沉淀。本研究结果探明了草鱼MHCⅠα、Ⅰβ、MHC Ⅱα、Ⅱβ、Ii和CLIP蛋白分子在真核细胞所定位的细胞器(细胞膜、内吞体和内质网);草鱼Ii能够分别结合MHCⅠ类和Ⅱ类分子的4条链(Ⅰα、Ⅰβ、Ⅱα和Ⅱβ),与之形成两种三聚体(Ⅰα/Ⅰβ/Ii和Ⅱα/Ⅱβ/Ii),而Ii的CLIP则是结合MHC两类分子并形成三聚体的关键活性片段。这些结果丰富了鱼类Ii与MHC分子关系的理论知识,为进一步研究和探明Ii在免疫应答中的作用提供了实验基础。