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目的:研究采用RNAi技术抑制Skp2基因表达后,Skp2 siRNA重组质粒对兔结膜下Tenons囊成纤维细胞生长、增殖的抑制情况,以及对细胞周期信号因子P27的影响。探讨Skp2与P27kipl之间的关系,及Skp2基因作为青光眼术后瘢痕形成化基因靶点治疗的可行性。
方法:
1、采用混合消化法体外培养兔结膜下Tenons囊成纤维细胞,作为下一步RNAi基因沉默的研究对象。
2、通过脂质体介导将质粒pSuppressorNeoSkp2siRNA、质粒pSuppressorNeo转染至兔结膜下Tenons囊成纤维细胞,G418筛选出阳性克隆细胞。利用激光共聚焦技术和Western blot方法检测各组Skp2蛋白的表达水平的变化。
3、检测质粒对兔结膜下Tenons囊成纤维细生长、增殖的影响。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法和BrdU标记法检测细胞生长增殖情况,观察表达质粒转染细胞后对细胞的影响。
4、检测质粒对兔结膜下Tenons囊成纤维细内p27表达影响。利用Westernblot检测Skp2 siRNA表达质粒转染细胞后对细胞周期信号因子p27蛋白表达的变化,以探讨Skp2在细胞周期中对p27蛋白的调控作用,揭示其在细胞周期中的调控功能,以及在青光眼术后滤过泡瘢痕化发生和发展中的作用机制。
结果:
1、兔结膜下Tenons囊成纤维细胞中Skp2蛋白表达下调。激光共聚焦技术显示空白对照组、空质粒组Skp2蛋白表达呈阳性,质粒Skp2siRNA组Skp2蛋白表达呈阴性;Western Blot检测显示空白对照组、空质粒组Skp2蛋白呈高表达,质粒Skp2siRNA组Skp2蛋白呈低表达。
2、Skp2 siRNA重组质粒转染兔结膜下Tenons囊成纤维细后,细胞生长、增殖明显被抑制。MTT法检测转染质粒DSuppressorNeoSkp2siRNA后兔结膜下Tenons囊成纤维细胞与转染质粒pSuppressorNeo组和未转染组比较增殖受到明显抑制,转染质粒pSuppressorNeo组细胞增殖也受到抑制,但抑制效果低于质粒pSuppressorNeoSkp2siRNA组;BrdU标记法检测兔结膜下Tenons囊成纤维细胞的增殖,Skp2siRNA转染后的第二天兔结膜下Tenons囊成纤维细胞的增殖受到抑制,而且随着时间的增加抑制作用增强。
3.兔结膜下Tenons囊成纤维细胞中P27蛋白表达上调。Western Blot检测显示空白对照组、空质粒组p27蛋白呈低表达,质粒Skp2siRNA组p27蛋白呈高表达。
结论:Skp2siRNA重组质粒对兔结膜下Tenons囊成纤维细胞增殖有明显抑制作用,抑制细胞内Skp2表达后能上调细胞内细胞周期调控因子p27蛋白的表达Skp2有望成为青光眼术后滤过泡瘢痕化基因治疗的靶点。