叶片作为植物不可缺少的组织,是进行光合作用产生有机物的生产车间。叶色突变是一种发生频率较高且容易被识别的遗传现象。叶色突变体是叶绿素合成与代谢的研究、光合作用的研究、高光效育种和观赏植物培育等的重要材料。叶绿素是参与光合作用最关键的物质之一,因此借助叶色突变体对叶绿素合成及代谢相关过程进行研究,可以为光合作用最大化提供理论基础。本实验的出发点是基于前期研究发现的一株拟南芥T-DNA插入叶色突变体cbd1（chlorophyll biosynthetic deficiency 1）。我们利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术获得其同源基因 CBD2（Chlorophyll Biodegradation Deficiency 2）的突变体cbd2及双突变体cbd1cbd2。借助三种突变体,本课题利用生物信息学、遗传学、生物化学、细胞生物学等手段对突变体cbd2及cbd1cbd2的基因、表型、叶绿素含量、光合作用水平、叶绿素中间产物含量、叶绿素降解产物含量和叶片离子含量等方面进行分析,初步探讨CBD2的功能及CBD1与CBD2间的作用关系。主要结果如下:1.定位于叶绿体基质的CBD2是进化保守的CBD1的同源蛋白CBD1和CBD2是拟南芥中仅有的两个Type Ⅱ CAAX金属蛋白酶超家族蛋白,氨基酸序列相似度高达58.39%。生物信息学预测表明CBD2有三个跨膜结构域,N端有71个氨基酸为cTP,有三个进化保守且与金属螯合功能相关的模体。通过拟南芥原生质体瞬时转化实验得知CBD2定位于酶促反应活跃的叶绿体基质。GUS化学染色转基因植株表明该蛋白在植株根、茎、叶、花和果荚等各个组织部位均有表达,且在叶片中表达量最高。2.CBD2有参与叶绿素降解途径的潜在功能cbd2功能缺失突变体具有典型的参与叶绿素降解途径的基因突变后的表型,即正常培养条件下无明显表型而黑暗诱导后呈现加速衰老现象。qRT-PCR分析表明cbd2中叶绿素合成途径关键基因在黑暗诱导后表达量不发生明显变化,cbd2中的叶绿素合成中间产物积累与WT相同。然而,cbd2中叶绿素降解途径一些关键基因在黑暗诱导后会发生2-6倍上调,叶绿素降解非绿色中间产物RCC（红色叶绿素代谢产物）和FCC（有初始荧光的叶绿素代谢产物）在黑暗诱导后较WT中有不同程度的积累增多。以上结果表明,虽然与CBD2同源的CBD1经过前期实验结果证实参与叶绿素合成途径,CBD2却更可能参与叶绿素降解途径。3.cbd1cbd2有生长迟滞和相较cbd1更严重的黄化及衍生表型在正常培养条件下,cbd1呈现叶片黄化,其叶绿素含量下降约30%,Chla/b比值上升26%左右;cbd2无明显表型;cbd1cbd2双突变体具有比cbd1更明显的叶色变化,叶绿素下降量约为75%,Chl a/b比值上升44%左右,且植株发育成熟较慢较矮。黑暗诱导植物衰老3天后,cbd2和cbd1cbd2表现出明显加快的衰老现象并最终提前死亡,而cbd1没有此现象。透射电子显微镜观察叶绿体超微结构得出,cbd1cbd2双突的叶绿体呈现衰老状态,失去正常的梭形而变得浑圆、无正常的类囊体垛叠、无淀粉粒、有丰富的质体小球。叶绿素荧光检测所代表的光合作用强度分析表明,cbd1较WT光反应中心开放程度高,实际光化学效率高;cbd1cbd2反应中心开放程度高,实际光化学效率更高。通过荧光紫外分光光度计对叶绿素合成中间产物积累情况的分析显示,在叶绿素合成前体ALA和铁螯合剂DP药品的处理下,cbd1cbd2有比cbd1程度更高的镁卟啉和镁卟啉甲酯堆积。而二者的前一步中间产物原卟啉和后一步中间产物原叶绿素酸酯的含量与WT无明显区别。4.CBD1与CBD2的N端不存在物理互作酵母双杂交实验表明CBD1与CBD2的N端100个氨基酸不存在物理互作。二者并不以结合形式共同在叶绿素合成途径上发挥作用。综合以上结果,我们推测CBD2可能在叶绿体基质中参与叶绿素降解代谢途径。而且,CBD2与其参与叶绿素合成途径的同源蛋白CBD1在叶绿素循环上下游分别行使功能,却能共同导致植株叶色突变加剧,这一发现为进一步阐明叶绿素合成及代谢途径的调控机制提供了新方向。