狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus,RV)引起的一种人兽共患的烈性传染病,一旦发病难以医治。准确、及时、快速的诊断是临床治疗的前提,也是免疫监测、流行病学调查的主要手段,还是有效控制狂犬病的关键。狂犬病病毒的糖蛋白(glycoprotein,GP)是狂犬病病毒主要的结构蛋白之一,与病毒的感染和免疫有密切关系,是诱导产生中和抗体的主要蛋白,其免疫作用基本与全病毒疫苗相当。GP由524个氨基酸组成,前19个氨基酸构成疏水性信号肽,其膜外区的保守性高,且抗原表位主要集中在膜外区,是制备检测抗体的首选抗原。　　 本研究以RV HEP-Flury株的全长质粒为模板,采用PCR方法扩增获得GP去除信号肽基因的(G1)与膜外区基因(G2)。选取膜外区基因中抗原表位富集区基因,对其氨基酸密码子进行修饰并合成其序列(G3)。分别将G1、G2及G3基因片段亚克隆到表达载体pET32a(+),构建融合表达质粒pET32-G1、pET32.G2及pET32-G3,转化表达宿主菌BL21,并利用IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western-blotting和薄层扫描分析结果显示,表达的蛋白均具有良好的反应原性和特异性,通过密码子优化,G3基因片段的表达量比G1、G2基因片段明显提高。对G3重组蛋白大量诱导表达,利用HisTrap FF亲和柱对表达的蛋白进行纯化,使用超滤离心管对纯化的G3重组蛋白进行浓缩和脱盐,获得高纯度的糖蛋白。　　 本研究以纯化的G3重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,200μg/只,共免疫4次。断尾采血,建立间接ELISA方法测定血清抗体效价。取血清效价最高的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG 4000的作用下进行细胞融合。用HAT选择培养基对杂交瘤细胞进行培养,利用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆,重复4次,获得了3株能稳定分泌单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(分别命名为2-D2、4-H1、9-G4)。将阳性杂交瘤细胞注射BALB/c小鼠制备腹水,测定腹水效价在1:105以上。抗体亚型鉴定结果显示,单抗亚型为IgG1,轻链为κ链。杂交瘤细胞株连续培养30代以及冻存3个月后复苏,细胞生长良好,杂交瘤细胞分泌的抗体效价稳定。间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)和Western-blotting检测结果显示,3株单抗的腹水均能特异性识别G3重组蛋白与RV病毒,与犬六联苗(包括犬细小病毒、犬副流感病毒、犬瘟热病毒、犬传染性肝炎病毒、犬腺病毒Ⅰ/Ⅱ型和犬钩端螺旋体)无交叉反应。　　 本研究在成功表达GP的去信号肽基因和膜外区基因的基础上,对G基因一段抗原表位富集区基因的稀有密码子序列进行了分析和优化,提高G基因在原核细胞中的表达水平;获得了稳定、特异、高效的单克隆抗体,为狂犬病及狂犬病病毒的相关研究和应用奠定了良好的基础。