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目的:C25-OH修饰的达玛烷型皂苷具有比原型化合物更佳的水溶性和生物学效价,但目前关于25-OH-PPT型皂苷的生物活性和构效关系研究甚微,现有方法难以满足高效、规模化制备需求。微生物转化是活性新产物高效挖掘的重要手段,本研究首先基于真菌Y生物催化体系,转化制备系列PPT型皂苷的C25-OH衍生物。筛选水合皂苷的最佳生物活性,并进行机制和构效关系研究,为改善皂苷成药性和挖掘活性先导化合物奠定基础。与此同时,开发一种PPT型皂苷绿色、高效的定向水合加工的新方法,极大的增加了该类成分规模化制备和广泛应用的可能性。方法:1.利用真菌Y生物催化体系对七种PPT型皂苷进行转化,结合LCMS-IT-TOF与HPLC-QQQ-MS综合分析转化产物。开展时程实验,验证和补充了人参皂苷Rh1、Rg2、Rf的转化规律,建立了人参皂苷Rk3、Rg6、三七皂苷R1及R2的代谢途径。2.基于固相萃取技术,优化建立PPT型C25-OH皂苷的分离纯化方法。放大转化人参皂苷Rh1、Rg2、Rf和三七皂苷R2,纯化制备目标水合产物,并采用HRMS、~1H-NMR、13C-NMR、HSQC及HMBC等方法对化合物进行结构鉴定。3.以LPS诱导的RAW264.7细胞为炎症模型,以NO和IL-6水平为考察指标,评价人参皂苷Rh1、Rg2、Rf、三七皂苷R2及其C25-OH衍生物等八种皂苷的抗炎活性。以Hela细胞、A549细胞为肿瘤模型,Glu诱导的HT22细胞为神经损伤模型,DOX诱导的H9c2细胞为心肌损伤模型。采用CCK-8法,分别考察八个皂苷在10～100μg/m L浓度范围内对细胞存活率的影响,评价其抗肿瘤、神经细胞保护以及抗心肌损伤的活性。4.以20（S）-Rh1和25-OH-20（S）-Rh1为研究对象,测定其对DOX诱导的H9c2细胞模型的抗氧化能力、凋亡率、ROS、线粒体膜电位、周期及自噬相关蛋白（LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin-1）表达的影响;采用分子对接辅助分析,以LY294002为PI3K抑制剂,以p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、Caspase-3）表达及细胞活力等为指标,评价药物对PI3K/AKT/eNOS信号通路的影响。5.采用HPLC-QQQ-MS法,以人参皂苷Rh1为底物,以转化效率、产物立体选择性及副产物比率等为指标,筛选PPT型皂苷定向水合催化剂。采用单因素结合灰色关联度法,考察催化剂用量、反应温度、助溶剂等影响,优化建立一种基于磺化固体酸的水合催化工艺。开展反应的水合动力学研究及九种PPT型皂苷的转化实验,验证方法可行性。结果:1.真菌Y催化七种PPT型皂苷的主产物有八种,转化途径分别为:“人参皂苷20（S）-Rh1→25-OH-20（S）-Rh1→25-OH-20（R）-Rh1”、“人参皂苷20（S）-Rg2→20（S）-Rf2→20（R）-Rf2”、“人参皂苷20（S）-Rf→25-OH-20（S）-Rf→25-OH-20（R）-Rf”、“三七皂苷R1→20（S/R）-R2→25-OH-20（S/R）-R2”、“三七皂苷20（S）-R2→25-OH-20（S）-R2→25-OH-20（R）-R2”、“人参皂苷Rg6→Rg2→20（S/R）-Rf2”、“人参皂苷Rk3→20（S/R）-Rh1→25-OH-20（S/R）-Rh1”。2.成功制备得到八种水合衍生物25-OH-20（S/R）-Rh1、20（S/R）-Rf2、25-OH-20（S/R）-Rf和25-OH-20（S/R）-R2,纯度均高于95%。3.活性筛选结果表明,在实验浓度下,八种皂苷对H9c2、HT22及RAW264.7细胞均无毒性;仅部分化合物对Hela、A549细胞和受损的HT22细胞的存活率具有影响。在LPS诱导的RAW264.7细胞模型中,八种皂苷对炎症因子的释放有一定抑制作用,但仅部分衍生物的抑制作用显著高于原型皂苷。值得关注的是,在DOX诱导的H9c2细胞损伤模型中,八种皂苷均能显著提升损伤的H9c2细胞的存活率。特别是治疗性给药,C25-OH衍生物的细胞活性比原型皂苷提升约20%,其中以25-OH-20（S）-Rh1最为突出,作用效果甚至高于阳性对照药物。4.心肌损伤修复的作用机制研究表明,20（S）-Rh1和25-OH-20（S）-Rh1能够显著逆转DOX所致H9c2细胞的SOD、MDA、LDH、ROS和线粒体膜电位的异常变化,并可减少细胞凋亡率,调控细胞周期。同时,能够显著降低Bax、Caspase-3的表达,提高Bcl-2、LC3-Ⅱ/Ⅰ、p62和Beclin-1的表达。对于PI3K/AKT/eNOS信号通路,20（S）-Rh1及其衍生物能够增加p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-eNOS/eNOS表达;而PI3K抑制剂的加入,逆转了药物对细胞活力、凋亡及相关蛋白表达的影响。25-OH-20（S）-Rh1表现出比原型皂苷更为显著的活性,分子对接结果进一步表明,C-25位羟基化增强了皂苷与PI3K/AKT/eNOS通路关键靶点的氢键作用力,可能是C25-OH衍生物活性增强的分子机制。5.转化温度是影响磺化固体酸介导的PPT型皂苷水合催化的最大因素,优化的最佳工艺为:以固体酸Amberlyst-15为催化剂,固相与液相比1:10（g/m L）,无助溶剂或5%甲醇为助溶剂,反应温度为40℃。动力学研究证实反应符合一级动力学,水合过程放热,活化能低。九种PPT型皂苷的验证实验表明,该体系可催化皂苷发生C-20位脱糖基和C20-C22/C24-C25位双键水合反应,水合衍生物的转化率均大于90%,反应3～6 h即可完成。结论:课题基于真菌Y生物催化体系的定向、区域选择性水合的特性,挖掘并制备了八种PPT型皂苷的水合衍生物。活性筛选及作用机制研究表明,PPT型皂苷具有更好的心肌损伤修复作用。20（S）-Rh1和25-OH-20（S）-Rh1可能通过抑制氧化应激、抗凋亡、自噬调控,从而降低心肌的毒性损伤,凋亡的抑制作用与激活PI3K/AKT/eNOS信号通路有关。PPT型皂苷的C-25位羟基化修饰,增加了生物活性及其与PI3K/AKT/eNOS靶点的结合能力,可作为心肌损伤相关疾病治疗的潜在药物。此外,课题还开发了一种固体酸介导的PPT型皂苷定向水合的加工方法,该法稳定可控,转化效率高、立体选择性好,且几乎无副产物产生,符合规模化绿色制造的需要。