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本研究以香果树的未成熟种子为外植体,通过固体和液体悬浮培养技术,对影响香果树体细胞胚胎发生的多种培养因子进行筛选,建立了稳定的香果树体细胞胚胎发生的培养体系;通过不定芽直接再生和愈伤组织诱导香果树器官发生两种途径,建立了香果树快速高频率发生的植株再生体系。并从组织细胞学、同工酶酶谱以及遗传变异等方面,对香果树体细胞胚胎形态建成的机理进行研究,结果表明:
1、以香果树叶片为外植体在添加1.0mg/L6-BA和1.0mg/L2,4-D的MS固体培养基中培养产生愈伤的频率为100%,愈伤组织在添加0.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS固体培养基中分化得到不定芽,分化频率为94.35%,平均每块愈伤产生再生芽1.95个。将香果树叶片培养在添加6-BA或ZT的MS培养基中,不经过愈伤的分化阶段,直接不定芽的诱导频率达到100%。在2.0mg/L6-BA作用下,培养40d后平均每个外植体产生再生芽(芽高=5mm)的数目达到15个;在1.0mg/LZT作用下,培养40d后平均每个外植体产生再生芽(芽高<5mm)的数目达到56.67个/cm2。黑暗预培养有利于香果树叶片外植体芽的再生。两种途径得到的再生植株转到1/2MS培养基上均可生根,生根率达100%,并且添加1.0mg/L的IBA和0.5%的活性炭有利于再生植株根的生长。小苗移栽到温室95%能够存活。
2、香果树的未成熟种子在MS+6-BA2.0mg/L+3%蔗糖的固体培养基上愈伤组织诱导率达100%;将愈伤组织转接到附加6-BA和NAA不同组合的MS固体培养基上可诱导体细胞胚的形成,其中在MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+3%蔗糖培养基上诱导率可达100%,可以得到不同时期的体细胞胚,并且体细胞胚增殖快,生成的子叶胚也比较多。
3、悬浮培养条件下,最适的接种量为2%(鲜重);较适合的基本培养基为MS;1%的蔗糖浓度容易使球形胚聚合体愈伤化,3%和6%的蔗糖浓度适合球形胚聚合体增殖,9%的蔗糖容易使球形胚聚合体褐化;添加0.5mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS液体培养基,当初始蔗糖浓度为3%,然后逐步提高蔗糖浓度到6%有利于香果树各个发育阶段的同步化;子叶胚转到不含任何植物生长调节剂的MS固体培养基上,可以长成正常植株。
4、石蜡切片观察表明,香果树体细胞胚胎发生于胚性愈伤组织中的一个或多个原始细胞组成的原胚,原胚经球形胚、心形胚、鱼雷胚发育成子叶胚。组织化学染色观察结果表明,香果树体细胞胚胎发生过程中的淀粉积累仅发生在由愈伤组织向胚性愈伤组织转变的过程中,原胚和球形胚时期胚体外包被富含淀粉的细胞层,从心形胚时期开始,淀粉细胞层解体消失,仅在胚柄端保留淀粉细胞层以提供胚体细胞分裂和生长所需要的物质和能量。
5、用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术(PAGE)对香果树体细胞胚胎形态建成过程中过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、淀粉酶(AMY)和超氧化物歧化酶(SOD)四种同工酶进行分析。结果表明:香果树体细胞胚胎形态建成过程中,POD、EST、AMY和SOD活性变化与胚性愈伤组织的诱导及体胚的发育密切相关。非胚性愈伤组织、胚性愈伤组织和体细胞胚之间,酶谱差异明显。
6、用随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记方法,从DNA水平上分析野生型香果树以及通过器官发生途径和体细胞胚胎发生途径得到的香果树再生植株以及体细胞胚胎发生过程中不同继代次数的胚性愈伤组织之间的遗传变异。筛选了100个随机引物,其中有75条随机引物能够扩增出条带,从中选取11个引物进行PCR扩增的结果显示:香果树体细胞胚胎无性系中有RAPD多态性位点,在胚性愈伤组织中也检测到少数RAPD变异位点。