目的： 胃癌是当今世界范围内第二位常见的恶性肿瘤。在我国，胃癌是肿瘤死亡的主要原因之一。虽然根治性手术后早期胃癌的5年生存率超过90％，但是晚期患者的预后较差，5年生存率不足10％。在我国，大约2/3的患者确诊时已属晚期，不能手术切除，放化疗是治疗晚期胃癌的主要手段。虽然阿霉素、氟尿嘧啶、多西紫杉醇及草酸铂等化疗药物的应用使晚期病人的生存期有所提高，但总体疗效仍不理想。 蟾蜍灵(Bufalin)是传统中药蟾酥的有效成分之一，国外及我们的研究显示它可以诱导多种白血病细胞和一些实体瘤细胞凋亡，并下调Bcl-2、c-myc、WT-1等肿瘤相关基因的表达，活化丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号转导通路。但其诱导凋亡的确切机制仍不清楚。 磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)/Akt信号转导通路在维持细胞生存和抑制细胞凋亡中起关键作用。活化的Akt可通过磷酸化Bad、Caspase-9和活化转录因子NF-κB等发挥抗凋亡作用。许多细胞毒药物都可通过抑制PI3K/Akt通路诱导细胞凋亡。但PI3K/Akt通路在蟾蜍灵诱导肿瘤细胞(特别是胃癌细胞)凋亡中的作用目前尚未见报道。 为深入研究蟾蜍灵诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制，本实验以人低分化胃粘液腺癌细胞株MGC803为模型，对Bcl-2家族、Survivin和Caspase-3等凋亡相关蛋白以及PI3K/Akt信号转导通路在蟾蜍灵诱导细胞凋亡过程中的作用进行了研究，同时对PI3K/Akt通路上游分子泛素连接酶Cbl-b在此过程中的调控机制进行了初步探讨。 材料与方法： 1、采用MTT法测定细胞活力，绘制增殖曲线。 2、采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞周期解析及凋亡判定。 3、采用瑞氏-姬姆萨染色，光学显微镜下观察细胞形态学变化并测定分裂指数。 4、采用Rhodamine123单染法检测线粒体跨膜电位。 5、采用Westernblot检测Bcl-2、Bax、Survivin、Caspase-3，、Akt、p-Akt和Cbl-b蛋白的表达。 6、统计学处理：每次实验重复3次，数据以(x)±s表示，采用SPSS13.0软件进行t检验和单因素方差分析。 实验结果： 1、蟾蜍灵以时间、剂量依赖性方式抑制MGC803细胞增殖，24h、48h和72h抑制细胞增殖50％的药物浓度(IC50)分别为96.03nmol/L、29.72nmol/L及12.31nmol/L。20nmol/L蟾蜍灵作用MGC803细胞24h后，流式细胞仪结果显示出现明显的G2/M期阻滞，G2/M期细胞百分数为41.43±4.85％，对凋亡无明显影响。形态学表现为M期阻滞，细胞出现双核及停滞于分裂中期。此时，分裂指数由对照组的3.57±0.32％增加到15.97±1.96％(P<0.01)。80nmol/L蟾蜍灵作用MGC803细胞24小时后，出现明显的亚二倍体凋亡峰(sub-G1峰)，细胞凋亡率为18.76±2.42％，形态学可见典型的凋亡改变，表现为细胞膜完整，细胞质固缩，胞核固缩或碎裂，可见凋亡小体。 2、80nmol/L蟾蜍灵作用MGC803细胞12h和24h后，线粒体跨膜电位显著降低，Rhodamine123的平均荧光强度由对照组的2124.32±86.03分别下降至1502.44±84.09和1129.43±113.68(P<0.01)。20nmol/L和80nmol/L蟾蜍灵作用MGC803细胞24h，Bax蛋白表达分别上调至对照组的1.27和1.80倍，Bcl-2蛋白表达分别下调至对照组的75％和82％，Bax/Bcl-2比值分别增加至对照组的1.69和2.20倍；Survivin蛋白表达分别上调至对照组的2.21和2.27倍。80nmol/L蟾蜍灵作用MGC803细胞24h，Caspase-3出现裂解活化。 3、80nmol/L蟾蜍灵分别作用MGC803细胞1～16h，p-Akt蛋白在1h和8h表达轻微上调，至16h完全消失，而总的Akt蛋白水平没有变化，提示蟾蜍灵可抑制PI3K/Akt信号通路。预先用25μmol/LLY294002(PI3K特异性抑制剂)处理MGC803细胞1小时，然后加入80nmol/L的蟾蜍灵继续作用24h，MTT结果显示细胞增殖率由单药蟾蜍灵组的51.26±4.10％下降至39.89±3.10％(P=0.01)，流式细胞仪分析显示细胞凋亡率由18.46±2.76％增加至31.40±4.77％(P=0.015)，而LY294002单独作用24h仅轻度抑制MGC803细胞增殖，诱导少量细胞凋亡，说明LY294002增强了蟾蜍灵抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用。Westernblot解析结果显示，蟾蜍灵单药组Survivin蛋白表达为对照组的1.87倍；LY294002预处理后，Survivin蛋白表达降至对照组的1.33倍，说明LY294002部分逆转蟾蜍灵对Survivin表达的上调。而应用20μmol/LPD98059(ERK特异性抑制剂)预处理MGC803细胞，未增强蟾蜍灵抑制细胞增殖和诱导凋亡的作用，间接提示PI3K/Akt通路在蟾蜍灵诱导MGC803细胞凋亡过程中的作用更为重要。 4、80nmol/L蟾蜍灵分别作用MGC803细胞1～16h，Westernblot解析结果显示，Cbl-b蛋白在1h和8h无明显变化，16h时增加至对照组的2.83倍，Cbl-b上调的时间与Akt活性被抑制的时间一致。25μmol/LLY294002预先处理MGC803细胞1h后，加入80nmol/L蟾蜍灵继续作用1h和8h，Cbl-b蛋白表达分别下降至对照组的51％和44％，同时Akt活性被抑制。 5、2μmol/L钙动员阻断剂CsA预先处理MGC803细胞30min，然后加入80nmol/L蟾蜍灵继续作用16h，Westernblot解析结果显示，CsA单药组对Cbl-b无明显影响，蟾蜍灵单药组Cbl-b蛋白表达上调至对照组的2.23倍，应用CsA预处理后，Cbl-b蛋白表达下调至对照组的1.20倍，提示蟾蜍灵引起的钙内流可能是Cbl-b上调的原因之一。为进一步证实这一假设，本实验应用钙离子载体A23187和钙动员阻断剂CsA分别或联合处理MGC803细胞，检测Cbl-b蛋白的表达。Westernblot解析结果显示，1μmol/LA23187和2μmol/LCsA单独或联合处理MGC803细胞16h，A23187单药组Cbl-b蛋白上调至对照组的2.40倍；A23187与CsA联合作用组，Cbl-b蛋白表达为对照组的1.83倍，说明CsA部分逆转A23187上调Cbl-b的作用；而CsA单药组对Cbl-b表达无明显影响，提示在MGC803细胞内Cbl-b受钙的正向调节。 结论： 1、蟾蜍灵抑制胃癌MGC803细胞增殖，在低浓度时诱导细胞M期阻滞，较高浓度时诱导凋亡。蟾蜍灵在诱导MGC803细胞凋亡过程中，降低线粒体跨膜电位，上调Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，活化Caspase-3，同时上调Survivin蛋白表达。 2、蟾蜍灵在诱导胃癌MGC803细胞凋亡过程中抑制PI3K/Akt通路。预先抑制PI3K/Akt通路可增强蟾蜍灵抑制MGC803细胞增殖、诱导其凋亡的作用，并可部分逆转蟾蜍灵对Survivin的上调作用。 3、蟾蜍灵在诱导胃癌MGC803细胞凋亡过程中上调Cbl-b蛋白表达，钙动员阻断剂CsA部分逆转蟾蜍灵对Cbl-b的上调作用。 4、在胃癌MGC803细胞内，Cbl-b受钙的正向调节。