抗菌肽及其融合基因的克隆表达和功能鉴定

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:jinnsey
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持续有效地控制真菌病害是现代农业的一项重要研究课题。在世界范围内,由真菌侵染造成的作物生产与贮存中的巨大经济损失,每年可达到300至500亿美元。传统农业大量使用杀菌剂和农药来控制真菌病害,这不仅增加生产成本和引起环境污染,还会引起杀菌剂抗性物种的增加。由镰刀菌引起的赤霉病是危害多种粮食作物的一种重要病害,赤霉病不仅造成产量损失,而且产生的真菌毒素严重威胁人畜健康。赤霉病抗源贫乏,严重影响了抗赤霉病育种工作的进展。抗菌肽是生物细胞特定基因编码产生的一类小分子多肽,是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障,在植物抗病基因工程中有广阔的应用前景,但不同抗菌肽的作用特点及方式不同。因此,筛选、鉴定抗赤霉菌多肽及其融合蛋白,将为通过遗传工程来提高作物的抗赤霉病性提供材料和依据。  本研究根据小麦的密码子偏爱性,设计合成寡核苷酸片段,采用PCR方法合成四种抗菌肽基因,并利用点突变改变赤霉菌抗体基因序列,然后通过重叠延伸PCR构建抗菌肽与赤霉菌特异抗体的融合基因。将抗菌肽基因以及融合基因分别构建到原核表达载体和植物表达载体,进行原核表达及烟草瞬时表达、拟南芥稳定表达研究,并对所表达的蛋白进行抗赤霉菌的功能鉴定。  研究结果表明,通过基因合成的方式成功获得与设计序列完全一致的四种抗菌肽基因,改变了赤霉菌抗体基因,并构建了抗菌肽-抗体融合基因。这些抗菌肽及其融合蛋白的原核表达及纯化产物的抑菌研究表明,由于抗菌肽对细菌有毒害作用,虽然与GST融合表达,仍然无法纯化得到MsrA1,而Defensin可少量纯化,并对禾谷镰刀菌具有明显的抑菌作用;将抗菌肽及其融合蛋白基因构建到双子叶植物表达载体,转入根癌农杆菌后,经真空过滤法转入烟草叶片,在烟草叶片中瞬间表达3天后提取烟草叶片总蛋白,比较源于烟草的不同抗菌肽及其融合蛋白抑制禾谷镰刀菌的效率及其特点,结果表明四种抗菌肽以及抗菌肽-抗体融合蛋白均可有效抑制禾谷镰刀菌生长,其中四种抗菌肽的抑菌作用基本相当,而在抗菌肽-抗体融合蛋白中,MsrA1-D2和 Defensin-D2两种融合蛋白的抑菌作用显著优于 Pep3-D2或D4E1-D2融合蛋白,表明抗菌肽的长度可能影响融合蛋白的作用效率;在转基因拟南芥植株上接种尖孢镰刀菌进行抗病性鉴定,结果证实表达抗菌肽MsrA1的转基因植物对镰刀菌的抗性最强。这些研究结果为深入研究抗菌肽及其融合蛋白的抑菌机理及在基因工程中有效利用这些基因提供了资料。  
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