目的:肝缺血/再灌注（ischemia reperfusion,IR）损伤是肝胆外科手术中的关键问题。自噬和细胞凋亡已被证明与肝脏IR损伤有关。IL37是一种有效的抗炎细胞因子,其在多种炎症免疫反应中均具有调节作用。已知IL37具有保护肝脏缺血再灌注损伤作用。自噬在多种器官IR损伤中扮演着双刃剑的作用,但是,目前自噬与肝脏IR中IL37之间的联系仍然未知。因此,在本研究旨在通过体内外实验探讨IL37对肝缺血再灌注损伤及肝细胞缺氧复氧损伤中自噬的影响及其可能的保护作用机制。方法:1.构建C57BL/6小鼠70%热缺血再灌注损伤模型,各组均缺血1h,而后分别再灌注6、12及24 h,Western blot检测自噬相关蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ,Beclin1表达,免疫组化检测LC3蛋白水平,H&E染色观察组织损伤程度,免疫荧光观察Cleaved-Caspase3凋亡水平。而后根据结果选取自噬水平最高的时间点进行后续试验。2.根据上述时间点,于术前14天经尾静脉注射过表达IL37的AAV8,14天后行IR手术,实验分组为:对照（control）组,假手术（sham）组,缺血再灌注（ischemia reperfusion,IR）组,腺相关病毒阴性对照（AAV8-NC+IR）+IR组,过表达IL37腺相关病毒+IR（AAV-IL37+IR）组。RT-qPCR,Western blot及激光共聚焦检测AAV8感染效率;Western blot检测自噬相关蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1表达;微板法检测ALT和AST活力水平;透射电镜观察自噬体形成情况;H&E染色观察组织损伤水平;TUNEL法检测凋亡情况。评价IL37在体内对小鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用。3.体外构建HL7702细胞缺氧复氧（hypoxia reoxygenation,HR）模型。首先对细胞进行0、1、2、4、6、8 h缺氧,Western blot法观察自噬蛋白LC3B Ⅱ,Beclin1和p62水平,并以自噬最高时间点作为后续试验点。而后细胞给予0、1、2、4、6、8 h不同时间的复氧处理,Western blot技术检测自噬蛋白LC3B Ⅱ,Beclin1和p62蛋白表达,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3,Bcl2和Bax变化情况,信号通路蛋白AMPK,mTOR和ULK1的磷酸化活化水平;TUNEL法检测细胞凋亡。4.不同浓度重组IL37蛋白处理HL7702细胞,Western blot技术检测LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1蛋白表达,Celltiter试剂盒检测细胞活力。而后联合Rapmycin和3-MA共同处理细胞后,Western blot技术检测LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1,GFP-mRFP-LC3慢病毒观察细胞自噬流情况。5.过表达IL37慢病毒感染HL7702细胞,RT-q PCR,Western blot技术检测IL37表达,激光共聚焦观察GFP荧光强度。而后,通过应用慢病毒稳定株,进行HR,Western blot技术检测自噬蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ,Bcelin1和p62表达,透射电子显微镜观察HL7702细胞自噬体形成,LC3荧光双标慢病毒观察细胞自噬流强弱;Western blot技术检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase3,Bcl2和Bax变化情况,TUNEL染色观察细胞凋亡。6.运用AMPK抑制剂Compound C处理HL7702细胞,Western blot技术检测AMPK和Cleaved Caspase3蛋白表达;Compound C联合慢病毒稳定株处理HR后的HL7702细胞,Western blot技术检测AMPK、mTOR、ULK1磷酸化活化水平,自噬相关蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ、Beclin1和p62蛋白表达,Cleaved Caspase3、Bax和Bcl2蛋白表达。结果1.与sham组相比,I1R6,I1R12和I1R24组LC3B Ⅱ/Ⅰ,Beclin1的蛋白表达水平于I1R12时升高最明显,差异具有统计学意义（p<0.01）;LC3免疫组化与Western blot结果一致（p<0.01）;同时肝组织损伤随再灌注时间的延长而逐渐加重（p<0.01）;各时间点ALT与AST表达同样随再灌注时间的延长而逐渐加重（p<0.01,p<0.001）;肝组织凋亡随再灌注时间的延长而逐渐增加。2.与对照组相比,AAV-IL37组IL37的蛋白和mRNA表达水平明显高于对照组和AAV-NC组（p<0.001）;与sham组相比,IR组和AAVNC+IR组的LC3B Ⅱ/Ⅰ（p<0.01）和Beclin1（p<0.01）表达水平明显升高,而AAV-IL37+IR能有效抑制自噬蛋白的表达,差异具有统计学意义（p<0.01）。H&E染色表明,IR（p<0.001）组和AAV-NC+IR（p<0.001）组的肝损伤程度明显高于对照组和sham组,AAV-IL37（p<0.01）能明显改善组织损伤程度。肝细胞凋亡率最高见于IR（p<0.001）组和AAVNC+IR（p<0.001）组,AAV-IL37（p<0.01）可有效降低肝细胞凋亡率。3.与对照组相比,HL7702在缺氧2 h时LC3B Ⅱ/Ⅰ（p<0.01）,Beclin1（p<0.01）蛋白表达水平最高,而后下降,p62（p<0.01）表达水平最低,而后增加,故以此为研究时间点。根据筛选出的缺氧时间点,而后给予不同时间的复氧处理,与对照组相比,LC3BⅡ/Ⅰ（p<0.01）,Beclin1（p<0.01）在H2R6时表达水平最高,而后下降,p62（p<0.01）在H2R6时表达水平最低。各时间点凋亡蛋白Cleaved Caspase3,Bax逐渐增加（p<0.01）,Bcl2表达逐渐降低（p<0.05）。TUNEL结果与Western blot结果一致（p<0.01）。各时间点信号通路蛋白p-AMPK和p-ULK1（s317）表达逐渐增加并于H2R6时最高（p<0.01）,p-mTOR逐渐降低,并于H2R6时最低（p<0.01）。4.与对照组相比,不同浓度rh IL37（0、50、100、200、300ng/ml）对自噬相关蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin1的抑制效应呈剂量依赖性（p<0.05,p<0.01）,p62的蛋白表达则逐渐增加（p<0.01）。同时与对照组相比,300ng/ml的重组IL37最能同时促进细胞增殖（p<0.01）。与对照组相比,HR组LC3B Ⅱ/Ⅰ（p<0.05）,Beclin1（p<0.05）表达明显升高,rh IL37能有效抑制LC3B Ⅱ/Ⅰ（p<0.05）,Beclin1（p<0.05）表达,Rap具有协同促进HR引起的自噬的作用,IL37能够部分削弱Rap引起的LC3B Ⅱ/Ⅰ（p<0.05）和Beclin1（p<0.05）表达,3MA-能够部分削弱HR引起的LC3B Ⅱ/Ⅰ（p<0.05）,Beclin1（p<0.05）表达增加,而与单独的3-MA组相比,rh IL37联合3-MA更能抑制LC3BⅡ/Ⅰ（p<0.05）,Beclin1（p<0.05）的表达,差异具有统计学意义（p<0.05）。GFP-mRFP-LC3结果显示:与对照组相比,HR组对自噬体的诱导作用（黄点）升高,仅与HR组相比,雷帕霉素组的诱导作用进一步增强,rh IL37在雷帕霉素组中可以抑制这种增强效应。此外,仅与HR组相比,用3-MA能减少自噬体形成的数量（黄点）,IL37增强了3-MA的抑制作用,所有结果均具有统计学意义（p<0.05）。5.与LV-NC组相比,LV-IL37组中IL37的mRNA和蛋白表达水平均明显升高（p<0.01,p<0.001）。与NC组相比,NC+HR组中LC3B Ⅱ/Ⅰ,Beclin1表达明显升高,而p62表达则降低（p<0.05,p<0.01）。LVIL37+HR组中,LC3B Ⅱ/Ⅰ,Beclin1蛋白水平受到明显抑制,而p62蛋白表达则升高（p<0.05）。与NC组相比,NC+HR组中自噬体数目明显增加（p<0.001）,LV-IL37+HR组中自噬体数目明显减少（p<0.01）。GFPmRFP-LC3结果显示:在LV-NC+HR中,绿色和红色的dots明显多于LV-NC（p<0.001）组,表明自噬体形成,且自噬溶酶体形成,自噬流通畅;IL37能够有效的抑制HR导致的自噬体和自噬溶酶体的形成（p<0.01）,自噬流部分通畅,与预期结果比较一致。6.与LV-NC+HR组相比,LV-IL37能有效提高细胞增值率（p<0.01）。LV-NC+HR组中,凋亡蛋白Cleaved Caspase3,Bax表达明显高于LVNC组（p<0.05,p<0.01）,而Bcl2的表达则降低（p<0.05）,LV-IL37能显著降低Cleaved Caspase3,Bax,并提高Bcl2d的蛋白表达（p<0.05,p<0.01）。TUNEL结果显示,在LV-NC+HR中,细胞凋亡率明显增加（p<0.01）,而IL37能够有效抑制肝细胞凋亡（p<0.05）。7.不同浓度的Compound C（0、5、10、20、40μM）能有效抑制pAMPK（p<0.01,p<0.001）和Cleaved Caspase3（p<0.05）表达。与LVNC+HR组相比,在LV-IL37+HR组和LV-NC+HR+Compound C组中,LC3BⅡ/Ⅰ,Beclin1,Cleaved Caspase3,Bax蛋白表达受到明显抑制（p<0.05,p<0.01,p<0.001）,p62和Bcl2表达增加（p<0.05）。而在LVIL37+HR+Compound C组中我们观察到了自噬相关蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ,Beclin1,Cleaved Caspase3,Bax的蛋白表达更低于单纯应用IL37和Compound C的实验组,p62和Bcl2的蛋白表达在一定程度上得到了有效的提高。此外,Western blot结果表明,与LV-NC+HR组相比,在LVIL37+HR组和LV-NC+HR+Compound C组中,p-AMPK,p-ULK1（s317）蛋白表达受到明显抑制（p<0.05,p<0.01）,p-mTOR,p-ULK1（s757）表达增加（p<0.05,p<0.01）。而LV-IL37+HR+Compound C组中我们观察到了p-AMPK,p-ULK1（s317）的蛋白表达更低于单纯应用IL37和Compound C的实验组（p<0.05,p<0.01）,而p-mTOR,p-ULK1（s757）的蛋白表达则更高于单纯应用IL37和Compound C的实验组（p<0.05,p<0.01）。IL37能通过该通路抑制自噬和凋亡发挥减轻肝缺血再灌注损伤的作用。结论1.自噬和凋亡相关蛋白在肝缺血再灌注损伤时表达逐渐增加,且与ALT、AST等众多指标呈正相关关系。2.成功构建AAV8过表达IL37的动物模型,并在IR模型上进行初步探讨证实IL37能在体内抑制IR引起的自噬和凋亡并减轻肝IR损伤。3.重组人IL37和IL37过表达慢病毒稳定株均能有效抑制HR导致的HL7702肝细胞的自噬,同时LV-IL37能够有效抑制自噬的同时减轻凋亡,并促进细胞增殖。4.IL37减轻肝细胞缺氧复氧损伤和肝缺血再灌注损伤的作用,其可能是通过调控AMPK/mTOR/ULK1信号通路实现的。