论文部分内容阅读
第一部分LKB1在小鼠肝缺血再灌注体内外模型中的表达目的:检测C57BL/6J小鼠肝脏缺血再灌注（Ischemia/reperfusion,I/R）体内外模型中的LKB1的表达水平。方法:首先,我们进行了小鼠肝脏I/R和RAW 264.7细胞缺氧复氧（hypoxia/reoxygenation,H/R）两种模型的建立。微板法检测I/R处理后丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（aspartate transaminase,AST）在小鼠血清中的浓度水平。蛋白免疫印迹法（Western blot,WB）检测肝脏激酶B1（Liver kinase B1,LKB1）的表达水平。苏木精-伊红（Hematoxylin and eosin,H&E）染色检测小鼠肝脏I/R后组织的损伤情况,Suzuki评分计算肝脏组织损伤程度。结果:成功构建小鼠肝脏I/R体内模型和RAW 264.7 H/R体外模型。小鼠肝脏I/R模型的处理时间越长,血清ALT和AST水平越高。组织病理切片提示I/R时,肝脏呈现不同程度的损伤改变,以肝细胞坏死、肝窦充血和空泡样变为主要病理改变。WB检测示LKB1表达随I/R时间和H/R时间延长而下降,分别在I1R6和H6/R6表达下降最为显著,因此确定最适I/R处理时间为I1R6;最适H/R处理时间为H6/R6。结论:LKB1在小鼠肝I/R和RAW 264.7巨噬细胞H/R模型中均表达下降,并确定最适I/R处理时间为I1R6;最适H/R处理时间为H6/R6。第二部分LKB1抑制NLRP3炎症小体减轻小鼠肝缺血再灌注损伤目的:研究LKB1在小鼠肝I/R损伤（ischemia reperfusion injury,IRI）中对肝脏功能的调控作用。方法:肝I/R手术前2周经小鼠尾静脉注射过表达LKB1的腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）。本部分的小鼠相关的实验随机分为如下4组:（1）Sham组:假手术组;（2）I/R组:缺血再灌注处理组;（3）I/R+AAV-NC:腺相关病毒阴性对照组;（4）I/R+AAV-LKB1:腺相关病毒过表达组。逆转录-聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）测定I/R模型中组织LKB1的m RNA表达。H&E染色观察肝组织损伤,Suzuki评分计算肝脏组织损伤严重程度;微板法测定小鼠血清ALT、AST的水平。酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunoassay,ELISA）检测肝脏I/R模型中TNF-α和IL-1β等炎性细胞因子在小鼠血清中的浓度水平。WB检测肝组织中LKB1和NLRP3、IL-1β、IL-18、caspase-1等蛋白的表达水平。结果:RT-PCR示AAV-LKB1组的组织LKB1 m RNA表达比Sham组和AAV-NC组均增高,与之相似地,AAV-LKB1组组织LKB1的蛋白水平比Sham组和AAV-NC组升高。H&E染色显示,I/R+AAV-LKB1组肝组织损伤程度较I/R组减轻。I/R+AAV-LKB1组小鼠血清ALT和AST水平较I/R组明显下降。与I/R组比较,I/R+AAV-LKB1组炎症因子IL-1β和TNF-α的水平显著降低。WB检测示I/R组NLRP3、IL-1β、IL-18、caspase-1的蛋白质表达较Sham组显著升高,而与I/R组相比,I/R+AAV-LKB1组上述分子表达水平降低。结论:LKB1可减轻小鼠肝I/R介导的肝脏组织损伤和炎症反应并对肝脏组织发挥保护作用,而这种保护作用是通过抑制NLRP3炎症小体的活化而实现的。第三部分LKB1通过FoxO1抑制NLRP3炎症小体减轻肝缺血再灌注损伤的机制研究目的:通过体外H/R模型探究LKB1减轻小鼠肝IRI的潜在具体分子机制。方法:使用过表达LKB1的慢病毒（Lentivirus,LV）感染RAW 264.7细胞,小干扰RNA（si RNA）下调FoxO1表达水平。构建RAW 264.7细胞H/R模型。第一部分细胞实验分组如下:（1）空白感染组（LV-NC）;（2）过表达LKB1的LV感染组（LV-LKB1）;（3）缺氧复氧+空白感染组（H/R+LV-NC）;（4）缺氧复氧+过表达LKB1的LV感染组（H/R+LV-LKB1）。第二部分细胞实验分组如下:（1）对照组;（2）缺氧复氧处理组（H/R）;（3）缺氧复氧+过表达LKB1组（H/R+LV-LKB1）;（4）缺氧复氧+过表达LKB1+下调FoxO1组（H/R+LV-LKB1+si RNA-FoxO1）。WB测定NLRP3、IL-1β、IL-18、caspase-1、p-IκB-α、p-NF-κB p65的蛋白质表达。免疫荧光检测NLRP3的表达定位和NF-κB p65的入核情况。ELISA分析检测RAW 264.7上清液中TNF-α和IL-1β表达水平。结果:成功构建出稳定过表达LKB1的RAW 264.7细胞株,同时筛选出下调FoxO1的最适si RNA序列。成功构建RAW 264.7细胞H/R模型。第一部分细胞实验结果如下:WB检测提示,H/R处理后,H/R+LV-LKB1组NLRP3、IL-1β、IL-18、caspase-1、p-IκB-α、p-NF-κB p65的蛋白水平显著低于H/R+LV-NC组。免疫荧光提示NLRP3的表达主要位于细胞质,H/R+LV-LKB1组的NLRP3荧光强度较H/R+LV-NC组显著减弱;NF-κB p65的核内荧光强度在H/R+LV-NC组显著增强,而在H/R+LV-LKB1组减弱。第二部分细胞实验结果如下:WB表达提示,体外H/R模型中,H/R+LV-LKB1组的NLRP3、IL-1β、IL-18、caspase-1、p-IκB-α、p-NF-κB p65表达水平均降低;当同时下调FoxO1表达水平时,NLRP3、IL-1β、IL-18、caspase-1、p-IκB-α、p-NF-κB p65表达水平均有一定程度的回升。免疫荧光提示:NLRP3表达定位于细胞质,H/R模型中,给予过表达LKB1处理后,NLRP3的荧光强度下降;而同时下调FoxO1表达后,NLRP3的荧光强度有所上升。ELISA检测提示:H/R组的上清TNF-α、IL-1β的浓度水平较Control组显著增高;过表达LKB1表达后,TNF-α、IL-1β的浓度水平显著下降;而下调FoxO1水平后,TNF-α、IL-1β的检测值有一定程度的回升。结论:LKB1通过抑制NLRP3炎症小体的活化减轻小鼠IRI,并且这种抑制作用可能通过FoxO1实现。