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多能干细胞具有在体外无限扩增并保持未分化状态的能力(自我更新),且具有分化为机体中所有种类的细胞及形成嵌合体动物的能力(分化)。干细胞多能性维持受特定转录因子复杂网络的调控。研究表明,转录因子Oct4、Nanog、Sox2参与干细胞多能性维持并阻断分化特异性基因的表达。Foxm1是Fox转录因子家族的一员,已有研究发现Foxm1调控细胞增殖与DNA损伤修复,并参与肿瘤发生发展过程。本文着重研究Foxm1是否参与维持干细胞多能性及相关分子机制：运用维甲酸(RA)诱导小鼠多能干细胞神经分化模型,考察Foxm1的表达水平与干细胞多能性的相关性,研究Foxm1对干细胞多能性相关基因表达的转录调节机制,证实Foxm1对干细胞多能性维持的重要生理功能。本文研究结果归纳如下：一：P19EC细胞是研究Foxm1参与干细胞多能性维持的良好干细胞体系。为确定P19EC细胞的多能性干细胞特性,我们首先证实P19EC干细胞能在裸鼠皮下形成畸胎癌,该畸胎癌具有三胚层来源组织结构：外胚层来源神经组织、中胚层来源肌肉组织、内胚层来源小肠上皮组织。同时,体外运用维甲酸诱导P19EC干细胞分化伴随碱性磷酸酶活性的丧失。按标准化方法用维甲酸诱导P19EC干细胞发生神经分化,RA诱导P19EC神经分化经历三个阶段：第一阶段P19EC多能性丧失(0-24h)；第二阶段变为神经干细胞(1-3d)；第三阶段P19EC分化为神经元,星型胶质细胞(6-7d)。在维甲酸诱导P19EC干细胞分化的早期,P19EC细胞碱性磷酸酶活性下降,失去多能性特征。同时,Foxm1及干细胞多能性维持基因Nanog、 Oct4、Sox2和Utf1表达水平出现明显下调,Foxm1在RA诱导1-2天时表达量急减,且Foxm1下降发生在Nanog、Oct4等基因下调之前。二：P19ECF细胞中抑制Foxm1表达导致多能性丧失及干细胞多能性相关基因Oct4和Nanog表达水平下降。维甲酸诱导P19EC干细胞分化早期伴随Foxml表达下降和已知干细胞多能性相关基因如Oct4、Nanog、Sox2等的表达抑制。运用能表达Foxm1siRNA的腺病毒载体AdFoxm1shRNA感染P19EC细胞,抑制Foxml的表达,同时也导致多能性相关的碱性磷酸酶活性丧失,并造成Oct4、Nanog和Sox2表达水平下降,表明Foxm1可能参与干细胞多能性的维持,并暗示Foxm1可能参与Oct4、Nanog等干细胞多能性维持基因表达的调控。三：P19EC干细胞中高表达Foxml阻止了干细胞分化过程中Oct4、Nanog和Sox2表达下调。由于前面实验结果暗示Foxml对干细胞多能性维持具有作用并可能参与Oct4、Nanog等干细胞多能性维持基因表达的调控,我们决定考察高表达Foxm1是否能抑制分化过程中多能性基因Oct4、Nanog和Sox2的表达下调。腺病毒载体AdFoxm1感染P19EC细胞后能有效高表达Foxm1。先用AdFoxml感染P19EC细胞再诱导分化过程,发现高表达Foxml阻止了分化过程中Oct、Nanog和Sox2的表达下降。同时还发现在已分化4天后的P19EC细胞高表达Foxm1能够回调多能性标志基因的表达,表明Foxm1能够回调分化细胞中已下调表达的多能性相关标志基因的编程状态。四：Oct4是Foxm1的靶基因。通过基因序列分析,我们发现Oct4基因的-5kb上游启动子上含有多个Foxm1的结合位点,分别在-3434bp至-3415bp、-2895bp至-2880bp、-1328bp至-1313bp存在Foxm1结合位点的集中区域,暗示Foxm1能够直接结合到Oct4的启动子上。运用染色质免疫沉淀实验证实,内源性Foxm1只结合于Oct4启动子的-3kb区域而不结合-1.3kb区域。将Oct4的启动子分段克隆到Luciferase报告基因质粒上,与Foxm1的表达质粒共转染实验发现,Oct4启动子的-3kb区域能有效介导Foxm1的转录活性。五：P19EC干细胞中抑制Foxm1表达导致干细胞出现自发性肌肉及中胚层分化。为进一步确定Foxm1与干细胞多能性维持有关,我们检测了抑制Foxm1表达后的P19EC细胞的分化能力。首先发现干扰Foxm1表达导致GATA4表达水平自发性增高。GATA4是心脏发育过程中的主要调节因子。我们进一步发现Foxm1被抑制的P19EC细胞注射到裸鼠皮下所形成的畸胎癌,癌体积明显小于对照组,并只发生中胚层方向的分化,特别是心肌细胞的分化,同时缺乏外胚层或内胚层分化标志物的表达,表明P19EC细胞中Foxml表达水平对干细胞多能性维持具有重要影响。六：在人胚胎成纤维细胞(HEFs)中高表达Foxm1重新启动Oct4、Nanog和Sox2表达。为了进一步证实Foxml能够回调分化细胞中多能性标志基因的表达状态,我们采用人胚胎成纤维细胞(hEFs)这一公认的已分化细胞,用AdFoxm1对hEFs进行多次重复感染(3次/4天间隔)。在hEFs中强迫表达Foxm1使成纤维细胞出现集落式生长,并且重新获得碱性磷酸酶活性。高表达Foxm1还导致hEFs中Oct4、Nanog和Sox2的表达升高,预示Foxm1诱导hEFs重新获得多能性。