论文部分内容阅读
研究背景脓毒症是机体对于感染的失控反应所导致可以威胁生命的器官衰竭。由于脓毒症高发病率和死亡率,其一直是重症监护最大的难题。在美国,每年有大约751000被诊断为脓毒症,其中大约10万人会死于此疾病。过度的炎症反应是脓毒症以及后续的多器官功能障碍综合征(MODS)最重要发生机制之一。而在脓毒症发病阶段,大量炎症介质会被释放,包括TNF-α、IFN-γ、IL-2等。有研究表明在脓毒症患者,特别是早期阶段过程中其TNF-α水平显著升高,且由于TNF-α可调节其它炎症因子和趋化因子的合成,所以它被认为是最重要的炎症介质之一。而巨噬细胞被认为是炎症因子的重要来源。最近,越来越多的研究关注细胞外组蛋白。因为它可通过诱导炎症介质释放和损伤线粒体来导致内皮损伤,细胞凋亡和器官衰竭。所以它被认为是导致脓毒症患者死亡的主要介质。细胞外组蛋白主要来源于中性粒细胞诱捕网或者死亡的组织细胞。细胞外组蛋白在组织损伤中起炎症介质作用。在体外研究证实组蛋白H4可诱导的TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10的释放,而抗组蛋白H4抗体可起到一定的保护作用。而Peter等人的研究也支持这一观点,他们证实组蛋白不仅可诱导炎症因子的释放,而且能加强脂多糖的促炎作用。以上研究都支持组蛋白的促炎作用。在20世纪50年代ALA被研究者从牛肝脏中分离出来的,当时它被误认为是维生素。但经过研究,ALA目前被证实是一种辅酶。它广泛存在于线粒体中,主要参与生物氧化反应。同时,ALA还是一种多功能的抗氧化剂,它主要是通过减少氧自由基产生来发挥其抗氧化作用。近年来,有研究证实ALA还具有抗炎作用。Zhang等人发现ALA可通过PI3K/Akt通路降低LPS诱导人单核细胞炎症反应。同时Gou等人也得到类似的结果.他们的研究表明,ALA可以延长脓毒症小鼠生存时间,并且通过NF-κB信号通路减轻炎症反应。综上所述组蛋白参与脓毒症过程中的炎症反应,但对于其介导炎症反应的机制尚不清楚,同时ALA对于组蛋白介导的炎症反应是否具有保护作用也尚不清楚。本研究通过使用RAW264.7细胞系来探究组蛋白介导炎症反应的机制以及ALA对其的抗炎作用。研究目的：1.明确组蛋白是否诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α;2.探明组蛋白介导RAW264.7细胞分泌TNF-α的受体及信号通路；3.明确ALA对组蛋白诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α作用及机制；研究方法1.RAW264.7细胞培养用含10%的胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM.置于5%C02,37℃培养箱中培养小鼠巨噬细胞RAW264.7。细胞增生至70%～80%汇合后进行传代,1-2天换液1次,4-6天传代1次。2.TNF-α检测将RAW264.7细胞用0.25%胰酶消化,以1X106个/ml接种于六孔板内。于第二天,用不同浓度组蛋白(Ong/ml、10μg/ml、25μg/ml)刺激细胞,置5%C02,37℃培养箱中继续培养12h,收集细胞上清液,以及用组蛋白(50μg/ml)刺激细胞并在不同时间(4h、6h、12h、16h)收集上清液。为了阻断TLR2、ERK、 p38、NF-κB通路以及明确ALA的作用,分别用抗TLR2抗体、ERK抑制剂、p38抑制剂、NF-κB抑制剂和ALA预处理1h后,再用组蛋白(50ug/ml)刺激细胞,置5%C02、37℃培养箱中继续培养12h,收集细胞上清液。ELISA检测试剂盒测定TNF-a(采用双抗体夹心ELISA法)。3.Western blot检测相关蛋白表达a)细胞信号通路ERK磷酸化检测将不同条件下处理好的细胞,用冷的PBS洗2遍,加入150μl RIPA细胞裂解液并立即放在冰上裂解30 min,用细胞刮快速刮下,转移到离心管中,在4℃,14000r/min,离心10 min,取上清。加入5×SDS上样稀释液,煮沸10min,将待检测蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳,PVDF膜转膜,5%胎牛血清蛋白或者脱脂奶粉中封闭,然后加入1：2000的pERK或者T-pERK抗体,4℃冰箱封闭过夜。第二天用TBST洗3遍,每遍15min后再分别加人1：8000的第二抗体。室温孵育1 h,ECL显影。将曝光后的胶片,通过凝胶成像系统扫描分析结果。用Quantity One图像分析软件进行灰度值(即吸光度)分析。将各部分的灰度值与各总蛋白条带灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量。b)细胞信号通路p38磷酸化检测将不同条件下处理好的细胞,用冷的PBS洗2遍,加入150μl RIPA细胞裂解液并立即放在冰上裂解30 min,用细胞刮快速刮下,转移到离心管中,在4℃,14000r/min,离心10 min,取上清。加入5×SDS上样稀释液,煮沸10min,将待检测蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳,PVDF膜转膜,5%胎牛血清蛋白或者脱脂奶粉中封闭,然后加入1：2000的p-p38或者T-p38抗体,4℃冰箱封闭过夜。第二天用TBST洗3遍,每遍15min后再分别加人1：8000的第二抗体。室温孵育1 h,ECL显影。将曝光后的胶片,通过凝胶成像系统扫描分析结果。用Quantity One图像分析软件进行灰度值(即吸光度)分析。将各部分的灰度值与各总蛋白条带灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量。c)细胞信号通路NF-κB p65磷酸化检测将不同条件下处理好的细胞,用冷的PBS洗2遍,加入150μl RIPA细胞裂解液并立即放在冰上裂解30 min,用细胞刮快速刮下,转移到离心管中,在4℃,14000r/min,离心10 min,取上清。加入5×SDS上样稀释液,煮沸10min,将待检测蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳,PVDF膜转膜,5%胎牛血清蛋白或者脱脂奶粉中封闭,然后加入1：2000的p-p65或者T-p65抗体,4℃冰箱封闭过夜。第二天用TBST洗3遍,每遍15min后再分别加人1：8000的第二抗体。室温孵育1 h,ECL显影。将曝光后的胶片,通过凝胶成像系统扫描分析结果。用Quantity One图像分析软件进行灰度值(即吸光度)分析。将各部分的灰度值与各总蛋白条带灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量。4.细胞活力检测用MTT法检测ALA对RAW264.7的细胞生长作用。将1×104个细胞铺于96孔板内,置于5%CO),37℃培养箱中培养。于第二天用不同浓度ALA(0,50, 100mg/L)刺激RAW264.7,共培养14h后,PBS洗两遍,每孔加入MTT (5g/L)10μl,避光培养4h,弃上清,每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 150μl。震荡10min,490nm波长处测定每孔吸光度值。统计学分析数据分析采用SPSS20.0统计学软件,数据结果使用均数±标准差(X±S)表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间两两比较采用Bonferroni’s检验,P值小于0.05被认为有意义。研究结果1.组蛋白通过TLR2信号通路诱导RAW264.7细胞的TNF-a分泌用组蛋白0μg/ml (正常对照组)、10μg/ml、25μg/ml刺激RAW264.7细胞,用ELISA方法检测其TNF-α分泌水平,发现组蛋白介导的TNF-α分泌有浓度依赖性(269.19±124.07,1757.38±421.63,2132.69±578.54,2780.87±1032.61,*P<0.05,**p<0.001)。用抗TLR2抗体预处理1h后,组蛋白诱导TNF-α分泌显著减少,具有统计学差异(1081.02±755.09 vs 3754.49±551.43,#P<0.05)。2.组蛋白通过TLR2通路导致ERK和p38的磷酸化组蛋白能诱导RAW264.7细胞激活ERK和p38通路,且呈时间依赖性,能在20min内迅速激活,并且在30min内达到高峰,最后随时问延长,组蛋白诱导RAW264.7细胞中的ERK和p38磷酸化水平逐渐降低。使用TLR2阻断抗体预处理RAW264.7细胞能够显著降低组蛋白诱导的ERK和p38的磷酸化。3.组蛋白通过TLR2通路导致NF-κB p65的磷酸化组蛋白诱导RAW264.7细胞激活NF-κB通路,且呈时间依赖性,能在20min内迅速激活,并且在60min内达到高峰,最后随时间延长,组蛋白诱导RAW264.7细胞中的NF-κB p65磷酸化水平逐渐降低。使用TLR2阻断抗体预处理RAW264.7细胞能够显著降低组蛋白诱导的NF-κB p65的磷酸化。4.组蛋白通过ERK、p38和NF-κB信号通路诱导RAW264.7细胞的TNF-α分泌我们分别使用PD98059(ERK的抑制剂)、SB203580(p38的抑制剂)和PDTC (NF-κB的抑制剂)预处理RAW264.7细胞1h后,再加入组蛋白共培养12h,收集细胞培养上清液检测细胞因子]fNF-α的分泌水平。与组蛋白组相比,加入抑制剂组可明显降低RAW264.7细胞的TNF-α分泌(2219.38±431.64,2030.61±306.26,2063.5±148.98 vs 4078.93±558.02)。5.ALA对RAW264.7细胞活力和TNF-α分泌的影响MTT法检测不同浓度ALA (0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)对RAW264.7活力的影响,结果显示在此浓度范围内,ALA对RAW264.7活力没有明显改变,差异没有统计学意义。对于TNF-α分泌的影响,ALA可明显降低组蛋白诱导的TNF-α的分泌(1891.27±575.57 vs 3842.55±717.38,P<0.05)。6.ALA抑制组蛋白引起的ERK、p38和NF-κB p65的磷酸化Western blot结果显示组蛋白导致ERK、p38和NF-κB p65的磷酸化较对照组增多(P<0.05)。用ALA预处理后,ERK、p38和NF-κB p65的磷酸化较组蛋白组降低(P<0.05)。实验结论1.组蛋白可能通过TLR2-MAPK和NF-κB通路诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α.2.ALA可能通路抑制ERK、p38和NF-κB通路抑制RAW264.7细胞分泌TNF-α.