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背景和目的:胶质瘤作为颅内的高度恶性肿瘤,由于侵袭性生长以及对放化疗的高度抵抗,使得胶质瘤术后极易复发,患者预后极差。近年来,随着肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)学说逐渐被证明,研究者认为胶质瘤的这种恶性进展、对放化疗的高度抵抗以及术后短时间内的高复发现象与胶质瘤干细胞(Glioma stem cells,GSCs)密切相关。因此,以胶质瘤干细胞作为靶点的治疗方法将成为全新的治疗手段。胶质瘤干细胞作为一种异常细胞,具有不断自我更新及无限增殖能力。然而,胶质瘤干细胞数目在胶质瘤中含量极少,比例约为10%。如此少量的胶质瘤干细胞增殖造成肿瘤复发将需要很长时间,因此单纯依靠胶质瘤干细胞学说并不能很好解释上述临床现象。由于胶质瘤的高代谢以及血管的异常紊乱,使得整个胶质瘤组织始终处于一个相对缺氧的环境中,其内包含了分化期胶质瘤细胞、胶质瘤干细胞、可溶性因子等。研究表明缺氧微环境可以加快胶质瘤干细胞的自我更新及增殖速率,但对于分化期胶质瘤细胞的影响目前研究较少。回顾文献,放化疗可以促使非乳腺癌干细胞逆转为乳腺癌干细胞,而放化疗本身即可以造成肿瘤进一步缺氧;另有报道显示未经分选的胶质瘤细胞在缺氧条件下培养可以促使胶质瘤干细胞比例逐渐升高,根据这些研究,我们推测:缺氧可以诱导分化期胶质瘤细胞逆分化形成胶质瘤干样细胞。近年来,有研究发现在肿瘤干细胞培养基中培养分化期胶质瘤细胞可以形成胶质瘤干细胞,而在缺氧环境下上述现象更为明显,这也进一步提示缺氧诱导胶质瘤细胞发生逆分化的可能,但由于上述研究局限于肿瘤干细胞培养基自身对分化期胶质瘤细胞的影响,因此仍不能说明单纯缺氧是否可以诱导分化期胶质瘤细胞发生逆分化形成胶质瘤干细胞。为证明这一科学假说,我们拟通过体外实验,采用单细胞成球、不对称分裂检测、免疫荧光、q RT-PCR、Western-blot等方法予以验证,并通过细胞增殖、凋亡、周期等检测予以辅助证明,从而为胶质瘤的治疗提供新的思考方向及治疗靶点。实验方法:第一部分:(1)细胞分选:采用免疫磁珠分选的方法分选得到CD133-胶质瘤细胞群;(2)单细胞成球:制成单个CD133-胶质瘤细胞悬液后于常氧、缺氧培养,每日镜下观察细胞生长状态并分别予0,3,7,14,21天行图像采集,统计成球数目并行数据分析;(3)不对称分裂生长特性检测:将由单个cd133-胶质瘤细胞缺氧培养21天后所成悬浮球体分别于胶质瘤干细胞培养基及分化培养基中培养,每日镜下观察悬浮球体生长状态并分别于1,3,5天行图像采集;(4)免疫荧光检测:将单个cd133-胶质瘤细胞缺氧培养21天后所成悬浮球体及原代胶质瘤细胞缺氧培养48小时后固定,通过免疫荧光检测方法检测肿瘤干细胞标记蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog、cd133)表达情况;(5)肿瘤干细胞标记蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog、cd133)rna表达检测:磁珠分选后的cd133-胶质瘤细胞分别缺氧培养0,3,6,9,12,24h后行qrt-pcr检测;(6)肿瘤干细胞标记蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog)蛋白表达检测:磁珠分选后的cd133-胶质瘤细胞分别缺氧培养0,12,24,48,72h后行western-blot检测;(7)cd133+细胞数表达检测:cd133-胶质瘤细胞缺氧培养0,3,6,9,12,15d后流式细胞仪分析cd133+细胞数表达改变情况。第二部分:(1)增殖检测:cd133-胶质瘤细胞行常氧、缺氧培养,分别予条件培养1,3,5,7,9,11d行cck-8检测细胞增殖;(2)凋亡检测:cd133-胶质瘤细胞行常氧、缺氧培养,分别予条件培养后1,3,5,7d行流式细胞仪凋亡检测;(3)周期检测:cd133-胶质瘤细胞行常氧、缺氧培养,分别予条件培养后1,3,5,7d行流式细胞仪周期检测。结果:(1)缺氧培养单个cd133-胶质瘤细胞可以悬浮成球,而常氧培养不能悬浮成球,即缺氧培养组成球能力高于常氧组(p<0.001);(2)缺氧培养单个cd133-胶质瘤细胞所成悬浮球体表现出不对称分裂特性;(3)缺氧培养单个cd133-胶质瘤细胞所成悬浮球体高表达肿瘤干细胞标记蛋白;缺氧培养原代胶质瘤细胞48h后同样高表达肿瘤干细胞标记蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog、cd133);(4)qrt-pcr及western-blot检测示缺氧培养后,肿瘤干细胞标记蛋白(sox-2、oct-4、klf-4、nanog、cd133)rna水平及蛋白水平均逐渐增高(p<0.05);(5)流式细胞仪检测发现缺氧培养cd133-胶质瘤细胞后,其胶质瘤干细胞经典标记物cd133+细胞数比例逐渐升高(p<0.05);(6)缺氧培养cd133-胶质瘤细胞增殖速率显著高于常氧培养组(p<0.001);(7)缺氧培养cd133-胶质瘤细胞凋亡率显著低于常氧培养组(p<0.05);(8)缺氧培养cd133-胶质瘤细胞周期阻滞于g0/g1期,且随着缺氧时间的延长,g0/g1期细胞数比例逐渐增多(p<0.05);结论:缺氧可以诱导分化期胶质瘤细胞发生逆分化形成胶质瘤干样细胞,形态学上表现为成球样悬浮生长,生物学上表现为高表达肿瘤干细胞标记蛋白,并呈现为快增殖、低凋亡及周期阻滞特性。