论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种以妊娠母猪的繁殖障碍以及仔猪的呼吸系统疾病为特征的高度接触性传染病,新生仔猪死亡率较高,并可引起免疫抑制及持续性感染。自我国首次报道PRRS至今,该病已历经20年的流行及演变,特别是2006年我国暴发高致病性PRRS(HP-PRRS),给养猪业造成巨大的经济损失。2008年,美国分离到PRRSV变异株NADC30,与北美经典毒株VR2332相比,其Nsp2蛋白存在131个氨基酸的不连续缺失。2012年以来,具有相同缺失特征的类NADC30毒株已在我国13个省市相继出现,且与国内PRRSV流行毒株发生重组。PRRSV具有高度变异的特点,导致毒株多样性显著,不同毒株在抗原性及致病性等方面存在一定差异,这也正是PRRS难以防控和消除的重要原因之一。本研究旨在通过对河南省PRRSV流行毒株进行分子检测及NSP2、ORF5基因的变异分析,并对流行毒株进行分离鉴定及全基因序列测定与分析,了解其部分生物学特性、分子变异特征和遗传进化情况,揭示河南地区PRRSV最新流行动态及变异趋势,以期为PRRS临床诊断、疫情预警、新型疫苗及抗病毒药物的研发提供科学的参考依据。1.2014-2015年河南省PRRSV的分子检测及NSP2、ORF5基因变异分析为了解河南省PRRSV流行毒株的分子特征及变异情况,本试验对2014-2015年采自河南各地165个养殖场的414份疑似PRRS的临床样品进行RT-PCR检测,并对PRRSV阳性样品的NSP2和ORF5基因进行测序及比对分析。结果显示,共检出PRRSV阳性样品123份,阳性率为29.7%;扩增得到50个NSP2和64个ORF5基因序列;遗传进化分析表明,河南地区PRRSV流行毒株主要为美洲型毒株,其中40株与美洲毒株NADC30高度同源,且该类毒株NSP2蛋白存在131个氨基酸的不连续缺失,与国内外已有报道一致;其余21株与我国HP-PRRSV代表性毒株JXA1高度同源。与2012-2013年相比,2014-2015年河南地区PRRSV流行毒株以类NADC30毒株为优势毒株,其在流行毒株中所占比例急剧上升;大多数HP-PRRSV毒株与疫苗株JXA1-P80亲缘关系较近,且PRRSV流行毒株的NSP2和ORF5基因均发生较大变异,提示弱毒疫苗的广泛使用及引种数量剧增可能是造成PRRSV优势流行毒株在河南地区发生改变并迅速扩散的重要原因之一。因此有必要对PRRSV的流行和变异进行持续监测,并对其致病性等方面进行深入研究,以期为临床诊断和疫病防控提供科学的参考依据。2.4株HP-PRRSV毒株的分离与鉴定将检测结果为PRRSV阳性的组织样品接种Marc-145细胞,通过连续传代进行病毒分离,并利用RT-PCR及间接免疫荧光试验(IFA)对分离毒株进行鉴定。结果显示,从52份阳性样品中成功分离到4株HP-PRRSV,分别命名为HENZK-1、HENPDS-2、HENZMD-5和HENXC-1,其第5代细胞培养物的病毒含量分别为105.77 TCID50/m L、106.75 TCID50/m L、104.80 TCID50/m L和104.36 TCID50/m L。本试验为研究PRRSV流行毒株的致病性及遗传进化等方面奠定了基础。3.HP-PRRSV毒株HENZK-1和HENPDS-2全基因组序列的测定与分析利用RT-PCR方法对分离株HENZK-1和HENPDS-2株全基因组进行扩增、测序与分析。结果显示,HENZK-1和HENPDS-2株全基因组长度分别为15019 bp和15020 bp,不含Poly(A)尾。序列比对分析显示,2个分离株Nsp2蛋白均存在30个氨基酸的不连续缺失,具有HP-PRRSV毒株的遗传特征,同时还存在新的变异。核苷酸序列的同源性及遗传进化分析表明,2个分离株与HP-PRRSV代表性毒株JXA1各代次致弱毒株(JXA1-P10~P170)及其3个疫苗返强毒株NT1、NT2和NT3的同源性分别为99.3%~99.4%和99.6%~99.8%,属于以JXA1为代表的亚群,且分布于同一个进化分支,与JXA1-P45和NT2亲缘关系较近,提示HENZK-1和HENPDS-2可能为疫苗返强毒株,回归动物试验初步结果表明它们具有明显的致病性。本试验为深入研究HP-PRRSV毒株的遗传演变规律及毒力等奠定了基础,同时也为疫病防控和疫苗研发及使用提供了科学的参考依据。4.PRRSV类NADC30毒株HENXX-1全基因组序列的测定与分析利用RT-PCR方法对河南流行株HENXX-1株全基因组进行扩增、测序与分析。结果显示,HENXX-1株全基因组长度为15019 bp,不含Poly(A)尾。核苷酸序列的同源性分析显示,其与NADC30的同源性为96.0%,与VR-2332、CH-1a和JXA1的同源性分别为85.3%、84.6%和84.0%。序列比对分析显示,HENXX-1株Nsp2蛋白存在131个氨基酸的不连续缺失,具有国内外已报道的类NADC30毒株的缺失特征。遗传进化分析表明,其属于以NADC30为代表的新亚群,且与国内类NADC30毒株亲缘关系较近。重组分析表明,HENXX-1株未发生重组,可能是NADC30的变异株。本试验为深入研究类NADC30毒株在中国的变异及遗传进化等提供了参考。