论文部分内容阅读
目的:系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）是一种累及多种系统及器官的自身免疫性疾病,其发生与多种因素相关,常伴有自身抗体产生。国内外学者的研究表明无论诊断SLE的时间长短,心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）始终是导致SLE患者死亡的首要原因,而SLE患者患CVD风险较高,主要与动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）加速有关。既往研究发现辅助性T细胞17（T helper cell 17,Th17）与调节性T细胞（regulatory T cells,Tregs）失衡是导致SLE患者AS高发的重要原因之一。而调节性B细胞（regulatory B cells,Bregs）可间接调节Th17/Treg细胞平衡从而抑制炎性因子的释放。因此,本研究我们通过比较SLE早发AS患者、SLE患者、健康人群血清中Bregs、Th17及Tregs相关细胞因子的表达,并建立LDLr-/-小鼠+Pristane模型,通过RT-PCR、流式细胞、ELISA等实验检测SLE早发AS小鼠Breg细胞的表达及其对调控Th17/Treg细胞平衡以及对下游炎性因子释放的影响,并分析其可能分子机制,为预防及靶向治疗SLE早发AS提供理论依据。方法:1、收集2020年4月～2021年1月在桂林医学院附属医院风湿免疫科住院的SLE患者,依据颈动脉彩色多普勒超声检查结果,将SLE患者进行分组,将颈动脉内膜中层厚度（carotid intima-media thickness,c IMT）≥1.0mm的SLE患者作为SLE-AS组;将c IMT<1.0mm的SLE患者作为SLE-non AS组。收集SLE患者细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α）检测结果和一般临床资料（如性别、年龄）、病程、体重指数（BMI）、疾病活动度（SLEDAI）、球蛋白、血脂组合（TG、CHO、HDL、LDL、APO-A、APO-B、LPa）、免疫一组（Ig M、Ig A、Ig G）、补体（C3、C4）、C反应蛋白（CRP）、血沉（ESR）、24小时尿蛋白水平。选取同一时间段在桂林医学院附属医院健康体检中心体检与SLE患者的性别、年龄匹配的健康体检者作为Control组,收集细胞因子（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ、TNF-α）检测结果和一般临床资料（如性别、年龄）,进行统计学分析。2、通过向10只8周龄的LDLr-/-小鼠腹腔注射Pristane试剂构建SLE早发AS小鼠的模型,作为SLE-AS组,同周龄的10只MRL/lpr小鼠作为SLE组,10只C57BL/6小鼠作为正常对照组,均为雌性,高脂饲料喂养14周后称重,记录观察各小鼠的皮肤毛发情况,摘眼球取血后检测白蛋白、血脂四项（TG、CHO、LDL、HDL）、补体C3、免疫球蛋白（Ig G）水平,取血清行酶联免疫吸附（ELISA）法检测抗核抗体（ANA）、抗双链DNA（ds DNA）抗体、细胞因子（IL-10、IL-17、IL-35、TGF-β、TNF-α）,取肾脏组织行HE染色、PAS染色,取主动脉行油红O染色;取脾脏后通过流式细胞术检测Bregs、Th17、Tregs表达,通过RT-PCR检测IL-10、RORγt、Foxp3 m RNA表达。结果:1、临床研究的结果:（1）共纳入SLE-AS组患者29例,SLE-non AS组患者106例,均无吸烟史,均有使用激素治疗,Control组共纳入242例。（2）SLE-AS组患者的年龄、病程时间、BMI、CHO、LDL、APO-B、LPa、ESR水平均高于SLE-non AS组患者,差异具有统计学意义（P<0.05）。（3）与Control组比较,SLE-non AS组患者血清IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α水平明显升高,SLE-AS组患者血清IL-6水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。但SLE-AS组和SLE-non AS组患者的细胞因子水平比较差异均无统计学意义（P>0.05）。（4）多因素Logistic回归分析结果显示年龄（OR 1.081,95%CI 1.025,1.141;P=0.004）、BMI（OR 1.402,95%CI 1.134,1.732;P=0.002）是SLE并发AS的危险因素。（5）SLE-AS组患者血清IL-2与疾病活动度SLEDAI呈负相关性（r=-0.517）,IL-6与球蛋白呈正相关性（r=0.388）,IFN-γ与Ig M呈正相关性（r=0.537）,均具有统计学意义（P<0.05）。（6）SLE-AS组患者血清IL-10/IL-17比值与TG、CHO、LDL、APO-B及24小时尿蛋白呈负相关,具有统计学意义（P<0.05）。2、基础研究的结果:（1）LDLr-/-小鼠腹腔注射Pristane试剂并予以高脂饲料喂养后出现脱毛,并随着周龄增加,脱毛症状更加明显,MRL/lpr狼疮小鼠同样出现脱毛表现,普通C57BL/6小鼠则无上述现象。（2）高脂饲料喂养14周后,LDLr-/-+Pristane组小鼠（SLE-AS组）、MRL/lpr+生理盐水组小鼠（SLE组）、C57BL/6+生理盐水组小鼠（Control组）体重无明显差异（P>0.05）,但SLE-AS组小鼠、SLE组小鼠血清白蛋白明显低于Control组小鼠（P<0.05）。（3）SLE-AS组小鼠血清TG、CHO、LDL水平均高于SLE组小鼠、Control组小鼠,HDL水平则降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。（4）与Control组小鼠比较,SLE-AS组小鼠、SLE组小鼠补体C3水平降低,Ig G水平升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。（5）SLE-AS组小鼠和SLE组小鼠均有血清ANA、抗ds-DNA抗体水平明显升高（P<0.05）及病理显示的肾脏病变。SLE-AS组小鼠主动脉油红O染色可见到橘红色的脂质沉积,但SLE组小鼠和Control组小鼠均未出现脂质沉积。（6）SLE-AS组小鼠和SLE组小鼠的IL-35水平均低于Control组小鼠,而TNF-α、IL-10水平均高于Control组,差异具有统计学意义（P<0.05）。与Control组小鼠相比,SLE组小鼠的IL-17水平升高,TGF-β水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。SLE-AS组小鼠血清IL-10水平明显高于SLE组小鼠,具有统计学意义（P<0.05）,但两者IL-17、IL-35、TGF-β、TNF-α水平的差异无统计学意义（P>0.05）。（7）与Control组小鼠比较,SLE-AS组小鼠和SLE组小鼠脾脏淋巴细胞中Treg细胞数量比例明显降低,而IL-10+Breg、Th17细胞数量比例明显增高,差异具有统计学意义（P<0.05）。SLE-AS组小鼠与SLE组小鼠脾脏淋巴细胞中Treg、Th17细胞数量比例比较,差异无统计学意义（P>0.05）。SLE-AS组小鼠和SLE组小鼠Breg细胞与Th17/Treg细胞比值均呈负相关,具有统计学意义（P<0.05）。（8）与Control组相比,SLE-AS组和SLE组小鼠Foxp3 m RNA的表达水平明显降低,而RORγt m RNA表达水平明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。SLE-AS组小鼠和SLE组小鼠Foxp3、RORγt m RNA表达水平的差异无统计学意义（P>0.05）。SLE-AS组小鼠IL-10 m RNA表达较SLE组和Control组小鼠均明显升高,具有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）本研究SLE合并AS患者年龄为（49.17±8.52）岁,提示具有早发趋势。（2）SLE合并AS患者的年龄、病程、BMI、CHO、LDL、APO-B、LPa、ESR水平与SLE未合并AS患者有显著差异;其中年龄、BMI是SLE并发AS的危险因素。（3）SLE患者的血清炎性细胞因子水平明显高于正常健康人群,SLE合并AS患者部分炎性细胞因子与免疫进展相关;IL-10/IL-17的比值与SLE合并AS患者的血脂异常和肾脏病变密切相关。（4）LDLr-/-小鼠通过腹腔注射Pristane可以成功诱导SLE早发AS小鼠模型,表现出与人类SLE患者相似的表型特征、血清学改变、免疫学异常及肾脏病变。LDLr-/-+Pristane小鼠通过高脂饲料喂养可以出现明显的高脂血症及AS斑块病变。（5）SLE早发AS小鼠体内存在明显的炎症反应及Breg/Th17/Treg细胞之间的失衡。（6）Breg细胞可能主要通过分泌IL-10调节Th17/Treg细胞失衡。