背景肿瘤的化疗耐药是导致肿瘤患者治疗过程中死亡的主要原因,但肿瘤化疗耐药具体的分子机制并不清楚。长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA。目前越来越多的研究表明,lncRNA在肿瘤的发生发展过程中,发挥着重要的作用。lncRNA发挥作用的机制较为复杂,近年来文献指出,lncRNA可以通过吸附microRNA间接调控基因的表达,参与肿瘤进程;可以通过吸附蛋白,对蛋白进行修饰,从而通过调控蛋白水平发挥作用;也可以在细胞核中富集,通过招募或者阻碍某些核转录因子结合,在基因的表达层面发挥调控作用;还可以实现对核小体空间的重新构向,继而改变基因的表达。lncRNA丰富的调控机制,使得lncRNA在肿瘤的发生发展过程发挥多种不同的功能。目前已有文献报道,某些lncRNA参与了肿瘤的化疗耐药过程,可能是导致肿瘤化疗耐药的关键因素。因此,研究lncRNA在肿瘤化疗耐药中的关键作用,将可以阐明肿瘤发生化疗耐药的新机制,补充肿瘤进展的理论依据,为临床治疗提供新的策略和药物作用靶点。目的:本研究通过筛选在胃癌组织中高表达的lncRNA,并分析其在胃癌化疗耐药中的作用。研究方法:(1)通过lncRNA芯片筛选出在胃癌组织中高表达的lncRNA; (2)通过qRT-PCR技术,在60例胃癌患者中检测该lncRNA的表达水平,并结合临床病理资料,分析该lncRNA的临床相关性;(3)检测该lncRNA在不同胃癌细胞中的表达情况,并通过干扰慢病毒在高表达该lncRNA的胃癌细胞中降低其表达,形成稳定低表达的胃癌细胞系作为模型;(4)采用CCK8实验、Transwell实验、划痕实验、流式细胞仪检测细胞周期、裸鼠皮下成瘤实验、裸鼠腹腔转移实验、裸鼠尾静脉转移实验,对该lncRNA的功能进行检测;(5)通过原位杂交技术,检测lncRNA在胃癌细胞和胃癌组织中的定位情况;(6)通过表达谱芯片分析该lncRNA参与细胞的具体功能;(7)通过RNA pull-down技术检测该lncRNA可能结合的蛋白,并分析其余lncRNA功能之间的关系;(8)检测lncRNA的表达对于胃癌细胞奥沙利铂敏感性的影响。研究结果:(1)筛选在胃癌组织中高表达的lncRNA:我们通过lncRNA芯片筛选出在胃癌组织中高表达的lncRNAs,并通过表达倍数、表达特异性筛选出15条在胃癌组织中高表达的lncRNA。同时在10例胃癌患者癌组织和癌旁组织中进行验证,最终确定表达差异最明显且最有统计学意义的lncRNA为lncRNA AK095203。(2)lncRNA AK095203在胃癌组织中的表达情况及其临床意义:我们通过qRT-PCR实验,在60例胃癌组织和癌旁组织中检测lncRNA AK095203的表达情况,发现lncRNA AK095203在胃癌组织中高表达(P=0.00662),且lncRNA的表达与胃癌大小呈正相关,与胃癌分化程度呈反相关。(3) lncRNA AK095203的表达对胃癌细胞行为学的影响:我们通过构建稳定低表达的胃癌细胞株SGC7901和BGC823,CCK8实验发现lncRNA AK095203的低表达,胃癌细胞的增殖能力受到了明显抑制;流式细胞仪检测细胞周期发现,干扰lncRNA AK095203的表达后,胃癌细胞难以进入G2期;Transwell实验和划痕实验表明,干扰1ncRNAAK095203可以明显抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力;裸鼠皮下成瘤实验、裸鼠腹腔种植转移实验、裸鼠强制肺转移实验则从体内实验角度证明了干扰lncRNA AK095203的表达,胃癌细胞的增殖和侵袭能力受到了明显抑制。(4) lncRNAAK095203在胃癌细胞和组织中的定位:我们通过原位杂交实验发现,lncRNA AK095203主要在细胞核中富集。(5)表达谱芯片分析lncRNAAK095203的具体功能:我们通过表达谱芯片检测发现,干扰lncRNAAK095203的表达后胃癌细胞的细胞分裂相关基因、DNA损伤修复相关基因的表达受到了明显抑制,提示lncRNAAK095203与细胞分裂、DNA损伤修复密切相关。(6)我们通过RNA pull-down实验发现,lncRNA AK095203可以与SSRP1和H2A/H2B结合,而SSRP1与胃癌奥沙利铂导致的DNA损伤修复密切相关,lncRNA AK095203可能是通过与SSRP1结合,从而导致胃癌奥沙利铂耐药的。(7)我们发现干扰lncRNA AK095203的表达后,胃癌细胞SGC7901和BGC823对奥沙利铂敏感性明显增加。结论:(1)我们通过lncRNA芯片和qRT-PCR实验,筛选出一条在胃癌组织中高表达的lncRNA,即 lncRNA AK095203,并通过临床病理资料分析发现,该lncRNA的表达与胃癌大小、分化程度密切相关。(2)转染干扰慢病毒,形成稳定抑制lncRNA AK095203表达的细胞系,并通过体内体外实验发现,干扰lncRNA AK095203的表达,胃癌细胞的增殖能力、侵袭能力受到了明显抑制。(3)表达谱芯片显示,lncRNA AK095203的表达,与细胞分裂功能、DNA损伤修复关系密切。(4)通过RNA pull-down实验和原位杂交联合免疫荧光实验,我们初步证明lncRNA AK095203可以与SSRP1和H2A/H2B结合。干扰lncRNA AK095203的表达,胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性明显增加。背景介绍在第一部分的研究过程中,我们通过lncRNA芯片,从中筛选出表达差异最为显著的lncRNA AK095203,并通过qRT-PCR技术在60例临床标本中检测其表达,发现lncRNAAK095203的表达与胃癌大小、分化程度密切相关,并初步通过RNApull-down实验发现lncRNAAK095203可能通过与SSRP1和H2A/H2B结合发挥促进DNA损伤修复的作用,从而促进了胃癌的奥沙利铂耐药。奥沙利铂是第三代铂类化疗药物,目前已被广泛的应用于临床肿瘤治疗。但部分肿瘤病人的治疗效果并不理想,究其原因是由于肿瘤细胞对奥沙利铂产生了耐药,从而导致胃癌细胞的恶性增殖和侵袭转移,这是造成胃癌患者死亡的主要原因。因此,研究人员一方面尝试通过不同手段解析胃癌患者奥沙利铂耐药的具体分子机制,期望通过对奥沙利铂耐药的分子机制研究,找到新的药物作用靶点,克服化疗耐药,另一方面新的治疗药物不断的被开发、合成,以期采用新的药物达到治疗肿瘤的目的。在这些新的药物中,纳米级合成物因其自身具有独特的性质,如自身体积、表面携带电荷、表面/体积比值等,受到了研究人员的广泛关注。氧化铈纳米颗粒(Cerium oxidenanoparticles,CNPs)是一类金属化合物纳米材料,铈离子可以在+3价和+4价中转换,具备了结合/释放活性氧的独特能力。活性氧是细胞内的重要第二信使,参与了生物体内多种生命活动。氧化铈纳米颗粒因其独特的结合/释放活性氧能力,在医学领域受到了极大的关注。Pesic等报道发现,氧化铈纳米颗粒对于结肠癌细胞HT-29和黑色素瘤细胞518A2具有明显的杀伤效果,但对正常细胞株并无作用,提示氧化铈纳米颗粒可以作为有效的潜在治疗黑色素瘤和结肠癌的药物。此外,在肺癌的研究中,人们也发现,氧化铈纳米颗粒可以通过增加细胞毒性和活性氧水平,从而发挥杀伤人肺癌细胞的作用,并且这种杀伤作用与氧化铈纳米颗粒的浓度和作用时间呈正相关。最近,研究人员又利用氧化铈纳米颗粒对于活性氧敏感的特性,开发出一种基于氧化铈纳米颗粒的药物释放系统,该系统可以携带不同的药物进入细胞内,从而发挥治疗肿瘤的效果。上述文献表明,氧化铈纳米颗粒具备有潜在治疗肿瘤的特性,但关于氧化铈纳米颗粒能否发挥治疗胃癌的功能尚不清楚。目的:探讨氧化铈纳米颗粒能否发挥治疗胃癌的功效,并对氧化铈纳米颗粒可能发挥功能的机制进行分析。方法和材料:(1)通过Transwell侵袭实验、CCK8增殖实验,检测不同浓度的氧化铈纳米颗粒(Oug/ml、0.01ug/ml,0.lug/ml,0.5ug/ml,lug/ml,10ug/ml)对胃癌细胞株 BGC823和MKN28侵袭和增殖能力的影响;(2)通过表达谱芯片、qRT-PCR、Western blot实验,检测不同浓度氧化铈纳米颗粒刺激后,胃癌细胞株BGC823和MKN28表达变化最明显的基因;(3)通过Westemblot和免疫荧光实验,检测该基因可能发挥的功能机制;(4)通过构建裸鼠皮下成瘤模型和腹腔种植转移模型,检测氧化铈纳米颗粒对胃癌细胞增殖能力和侵袭能力的影响。结果:(1)不同浓度的氧化铈纳米颗粒均可以抑制胃癌细胞株BGC823和MKN28的迁移能力,但仅有高浓度(10ug/ml)的氧化铈纳米颗粒可以发挥抑制胃癌细胞株BGC823和MKN28增殖能力;(2)氧化铈纳米颗粒与胃癌细胞共培养后,主要在细胞的溶酶体中富集;(3)氧化铈纳米颗粒刺激胃癌细胞,主要引起DEAH-box解旋酶15 (DEAH-box helicase15, DHX15)表达上调;(4) DHX15可以促使p38表达增高,但p38主要在细胞质中富集;(5)裸鼠皮下成瘤模型表明,高浓度氧化铈纳米颗粒可以抑制胃癌细胞的增殖能力,但低浓度的氧化铈纳米颗粒并不能发挥此作用;(6)裸鼠腹腔种植转移模型表明,氧化铈纳米颗粒可以抑制胃癌细胞的腹腔种植转移能力。结论:(1)低浓度氧化铈纳米颗粒可以抑制胃癌细胞的侵袭,高浓度氧化铈纳米颗粒可以抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力;(2)氧化铈纳米颗粒可能通过促进DHX15表达从而发挥上述功能的。