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目的:支架蛋白RACK1是重要的信号转导分子,课题组前期研究发现RACK1通过调控自噬维持外周T细胞数量,然而RACK1在B细胞中的作用仍不清楚。本研究通过建立RACK1在B细胞条件性敲除小鼠模型,探讨RACK1在B细胞发育、分化和功能中的调控作用,并对分子机制进行了初步探讨。方法:1.建立RACK1在B细胞中条件性敲除小鼠模型（经典敲除模型）,基因型为Rack1F/F;CD19-Cre,简写为KO小鼠,以同窝同性别的Rack1F/F小鼠作为WT对照。分别提取WT和KO小鼠基因组DNA,通过聚合酶链式反应从基因水平鉴定小鼠基因型;应用流式细胞术分选脾脏来源的CD19+B细胞,应用免疫印迹在蛋白水平鉴定RACK1分子的表达;制备小鼠脾脏组织切片,利用免疫组化验证RACK1分子的表达。2.利用Rack1基因打靶小鼠与Cd19-Cre ERT2转基因小鼠,建立RACK1在B细胞中诱导性敲除小鼠模型。经他莫昔芬诱导后,获得诱导性敲除小鼠,基因型为Rack1F/FCd19-Cre ERT2,命名为i KO小鼠,同窝同性别的Rack1F/F小鼠为WT对照。用免疫印迹验证RACK1分子在B细胞中的条件性诱导敲除。3.制备WT和KO小鼠的骨髓单细胞悬液,通过流式细胞术分析RACK1条件性敲除对B细胞发育阶段的影响。4.收集WT和KO小鼠外周抗凝血,制备小鼠脾脏单细胞悬液以及肝脏单个核细胞悬液,应用流式细胞术分析RACK1条件性敲除对外周B细胞及各亚群比例和数量的影响。用i KO小鼠验证RACK1分子对外周B细胞及各亚群的影响。5.采用免疫印迹法分析WT和KO小鼠脾脏B细胞中自噬标志蛋白LC3B本底表达水平的差异,以及anti-Ig M体外诱导BCR活化后,两种小鼠脾脏B细胞中LC3B表达的水平差异。6.应用免疫荧光技术验证WT和KO小鼠脾脏B细胞中自噬标志蛋白LC3B表达水平差异,证实RACK1对B细胞发育、分化和功能的影响与自噬的相关性。7.用anti-Ig M和anti-CD40体外诱导BCR活化,应用免疫印迹法分析WT和KO小鼠脾脏B细胞Erk1/2和Akt磷酸化水平的差异。8.用B细胞纯化试剂盒分别纯化WT和KO小鼠脾脏B细胞,分别于体外给予anti-Ig M、anti-Ig M/anti-CD40、LPS,刺激不同时间,应用流式细胞术分析RACK1对B细胞增殖（72h）、活化（12 h、24 h、48 h）和凋亡（24 h、48 h）的影响。9.采用小鼠背部皮下免疫的方法,在WT和KO小鼠中建立KLH免疫模型,收集特定时间点的小鼠血清,利用酶联免疫吸附法（ELISA）分析RACK1条件性敲除对小鼠免疫前后血清中KLH特异性抗体Ig M、Ig G水平的影响;应用流式细胞术分析RACK1条件性敲除对KLH免疫后,WT和KO小鼠脾脏生发中心B细胞和浆母细胞、浆细胞数量的影响。10.收集WT和KO小鼠的腹腔灌洗液,应用流式细胞术分析RACK1条件性敲除对腹腔B1细胞（B1a和B1b）比例的影响。结果:1.鉴定B细胞中条件性敲除RACK1分子的经典敲除小鼠。琼脂糖凝胶电泳结果表明,KO小鼠基因组中同时表达Rack1基因和CD19-Cre基因,而WT小鼠基因组中只表达Rack1基因;免疫印迹结果显示,与WT小鼠相比,KO小鼠B细胞中RACK1蛋白表达量显著降低;免疫组化结果表明,KO小鼠B细胞中RACK1蛋白表达量与野生型相比显著降低。2.成功构建B细胞中诱导性敲除RACK1分子的小鼠模型。免疫印迹结果显示,经他莫昔芬诱导后,i KO小鼠脾脏B细胞中RACK1蛋白表达量较WT小鼠显著降低。3.RACK1条件性敲除在骨髓B细胞发育中的作用。RACK1分子缺失导致经典敲除小鼠Pro B细胞（B220+CD43+）比例较WT小鼠有所升高（P<0.001）,而Mature B细胞(Ig M+B220hi)比例较WT小鼠下降（P=0.034）,提示RACK1分子缺失可能影响B细胞的早期发育。4.RACK1条件性敲除在外周B细胞稳态维持中的作用。流式细胞术结果显示,KO小鼠外周血以及肝脏单个核细胞中B细胞比例较WT小鼠显著下降（分别为P=0.015,P=0.011）,同时,其脾脏中CD19+B220+B细胞及T1 B(Ig Mhi Ig Dlo)、T2 B(Ig Mhi Ig Dhi)、FO B(CD21+CD23hi)、MZ B(CD21hi CD23lo)的细胞数量也较WT小鼠显著下降（分别为P=0.008,P=0.015,P=0.034,P=0.010,P=0.025）。在他莫昔芬诱导的RACK1敲除小鼠模型中证实了该分子缺失导致脾脏中B细胞和B细胞亚群数量均较WT小鼠显著降低。5.分子机制探讨。免疫印迹结果显示,B细胞条件性敲除RACK1分子的小鼠脾脏B细胞中LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的水平较WT小鼠降低,同时B细胞经anti-Ig M刺激活化后LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的水平也较WT和KO小鼠降低,提示外周B细胞数量下降可能与自噬途径存在相关性。免疫荧光结果显示,KO小鼠B细胞中膜型LC3B的表达水平较WT小鼠降低。证实RACK1条件性敲除小鼠B细胞存在自噬缺陷。6.RACK1条件性敲除参与BCR信号通路的调节。免疫印迹结果显示,在条件性敲除RACK1分子的小鼠脾脏B细胞中,关键通路分子p-Erk1/2和p-Akt的表达水平较WT小鼠脾脏B细胞低。7.RACK1参与调控体外诱导B细胞活化过程中B细胞的增殖和存活。流式细胞术结果显示,RACK1条件性敲除的KO小鼠B细胞增殖能力下降、活化水平略增加,而凋亡水平较WT小鼠显著增加,提示RACK1分子在B细胞的增殖和存活中发挥一定调控作用。8.RACK1影响B细胞体液免疫应答水平。经KLH蛋白免疫后,RACK1条件性敲除小鼠血清中抗原特异性Ig M和Ig G水平均较WT小鼠降低;生发中心B细胞（B220+GL-7+FAS+）的数量较WT小鼠降低（P=0.005）,浆母细胞(B220hiCD138+)和浆细胞(B220lo CD138+)数量均较WT小鼠显著降低（分别为P=0.001,P=0.044）,表明RACK1分子在B细胞介导的体液免疫应答中发挥调控作用。9.RACK1分子条件性敲除导致KO小鼠腹腔B1细胞(Ig M+CD19+B220lo)比例较WT小鼠显著下降（均为P<0.001）。结论:1.RACK1分子可能参与调控B细胞在骨髓中的早期发育,并维持外周B细胞和各亚群以及腹腔B1细胞稳态。2.RACK1正调控BCR信号通路,在B细胞体外激活过程中促进细胞存活。3.RACK1促进B细胞介导的特异性体液免疫应答。4.RACK1可能通过自噬途径调控B细胞的分化和功能。