干细胞分化心肌细胞的纯化及功能研究

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目前,心血管疾病是世界范围内的第一致死疾病。细胞替代治疗法已经成为治疗心脏类疾病的一种新策略。我们将嘌呤霉素抗性基因(PuroR)和钙示踪蛋白——GCaMP2置于心肌细胞特异性启动子αMHC promoter的启动下在干细胞分化心肌细胞中共同表达,用以富集干细胞分化成的心肌细胞,监测细胞命运,探索移植细胞在体内的功能。   我们研究了PuroR和GCaMP2共表达质粒中两个基因之间序列——核糖体进入序列(IRES)的第11位ATG与GCaMP2 ATG之间的间隔序列,对其表达的影响。结果表明,IRES序列后GCaMP2翻译的起始主要是从IRES序列的第11位AUG开始的。我们使用的3种间隔序列的核苷酸序列对于GCaMP2的表达没有影响,但这种序列的存在对于GCaMP2翻译起始又是必须的。我们将PuroR-IRES-GCaMP2元件至于αMHC promoter后,GCaMP2在大鼠平滑肌细胞系A10中得到表达,且可以指示ATP-Na+诱导的A10细胞中的Ca2+瞬变。将这种GCaMP2操纵元插入ROSA26外显子1和2之间的内含子处,以保证GCaMP2可以在ES cells诱导分化的心肌细胞中表达。   初步探究了心钠肽(Atrial Natriuretic Peptide,ANP)对于不同发育阶段的EScells诱导分化的心肌细胞和胚胎心肌细胞L型钙电流的影响(ICaL),结果表明ANP可以抑制这两种细胞的动作电位(AP)和ICaL。   另外,由于骨髓间充质干细胞作(MSC)为细胞移植的一种种子细胞来源的生物学基础存在争议,我们为了比较ES cells和骨髓间充质干细胞诱导分化的心肌细胞移植到心脏梗死区后呈现的功能,建立了可以在诱导分化心肌细胞中表达PuroR和DsRed的rMSC。rMSC诱导分化成的心肌细胞经puromycin富集后GR表达上调,但GATA4和Nkx2.5没有表达;经ATP-Na+诱导后可以产生钙瞬变;同时还可以监测到ICaL。
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