漆酶是一种重要的木质素降解酶,在自然界木质素的循环和利用中有重要的作用,同时漆酶对与木质素结构相似的许多环境污染物也有明显的降解能力,因此漆酶在环境保护、造纸工业、食品工业及生物传感器工业等领域的重要性越来越突出,人们对漆酶产品的需求也越来越强烈,漆酶在自然界中主要是白腐菌产生的。但白腐菌产漆酶的能力较低也很难适用工业发酵的要求。杏鲍菇是从常见白腐菌中筛选出来的,其酶学性质较为优越；表现在其最适作用温度较高且热稳定性和在最适pH值附件的pH值稳定性也比较好。本课题开始时,还没有关于杏鲍菇漆酶基因克隆的报道。同工酶分析表明,杏鲍菇共含有两种漆酶同工酶,一种为组成型的,一种为诱导型的。以杏鲍菇为材料,在非诱导的条件下克隆了其漆酶的基因并研究了漆酶的异源表达情况。以期找到一种适宜真菌漆酶表达的外源体系。实现漆酶的高密度发酵和缩短漆酶的生产周期。为工业化生产打下良好的基础,并为将来对漆酶进行分子改造以及快速定向进化奠定基础。论文共分五个部分。1.杏鲍菇漆酶基因的克隆。利用RT-PCR和PCR技术,以提取的杏鲍菇RNA和DNA为模板,分别克隆到了漆酶的cDNA和gDNA。测序发现杏鲍菇漆酶gDNA全长为2445bp; cDNA全长为1602bp。提交到GeneBank,获得登录号分别为FJ231091,FJ231092。序列分析表明,杏鲍菇漆酶共含有14个内含子。其长度一般为50—70bp,大都符合GT-AG规则。将cDNA在NCBI上进行BLAST比对发现,它和AM774000的同源性最高,为99%。2.漆酶高级结构的预测。利用生物信息学的知识对漆酶的高级结构进行预测,然后再分别使用软件CLC Protein Work bench和pymol初步解析了漆酶的二级和三级结构。获得了较为理想的三维立体模式图。其结构的初步预测为将来分析漆酶的活性中心和探讨它的催化机理提供了视觉上的帮助。3.杏鲍菇漆酶基因在大肠杆菌中的表达。将漆酶的cDNA构建到pET21b上,导入大肠杆菌BL21 (DE3)获得重组菌株。经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析表明漆酶蛋白得到了表达。当经破碎细胞后却无法检测到漆酶的活性。这可能与编码信号肽的部分存在有关,信号肽的存在能够影响肽链的正确折叠；也可能与外源蛋白的高效表达有关,高效表达的结果使得外源蛋白来不及正确折叠。4.漆酶基因在毕赤酵母中的表达。将编码漆酶成熟蛋白的cDNA构建到pPIC9K上,利用酿酒酵母α-factor作为信号肽,在毕赤酵母GS115中成功实现了活性表达。经G418的筛选和在含底物ABTS的MM平板上活性验证,筛选出一株酶活相对较高的转化子。经甲醇诱导6d后,酶活达到最高。SDS-PAGE分析表明,重组酵母发酵液的上清蛋白成份比较单一,有利于下游的纯化工作。5.漆酶的酶学性质研究。研究发现重组漆酶和杏鲍菇漆酶的酶学性质基本一致,杏鲍菇漆酶酶学性质的分析是在非诱导条件下测定的,重组漆酶和杏鲍菇漆酶的最适温度均为55℃,最适pH分别为3.4和3.6。并都具有较好的热稳定性和和在最适pH值附近的pH稳定性。这也从一方面说明了所克隆的基因是杏鲍菇中组成型的漆酶基因。