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SS1作为生长抑素(somatostatin-SS)基因家族的最原始基因,是由生长抑素前体(PPSS1)合成,在组织特异的蛋白酶作用下分裂产生的两种生物活性多肽(SS—14和SS-28),分别在C端14位和28位一致,是存在所有脊椎动物中常见的亚型。已有研究利用原位杂交技术确定了ss1在斑马鱼胚胎发育时期的中枢神经系统(CNS)和胰腺中表达。但是,对ss1在鱼类早期胚胎发育中的功能还缺乏研究。本实验室利用人工合成的针对SS1 mRNA起始密码子附近区域的morpholino靶向反义核酸,显微注射斑马鱼胚胎敲降SS1基因的表达,结果发现SS1的敲降显著降低了斑马鱼的运动能力,而且使斑马鱼的个体发育受到阻滞,体外合成的SS1 mRNA可以部分回救morphant表型缺陷。为验证SS1基因表达下降是否影响其他基因的表达,进一步探究SS1基因在胚胎发育时期的功能,本研究运用靶向mRNA基因表达敲降(knockdown)、体外转录合成mRNA在体表达、受精卵显微注射等发育遗传学技术,获得SS1敲降、SS1营救斑马鱼胚胎,选取发育到30hpf时期的胚胎,利用第二代深度测序技术,以野生型胚胎作对照,分别对敲降、营救的胚胎进行基因表达谱测序分析,筛选表达差异基因。本研究对解明SS1基因在斑马鱼胚胎发育时期的功能具有重要意义。选取30hpf的胚胎提取总RNA,对SS1基因敲降、营救、野生型胚胎进行表达谱分析,每组设两个生物学重复。对于每个处理组的两个生物学重复分别建库并进行Illumina高通量测序。每个文库产生大于11.77 M raw reads。经过低质量数据的过滤后,总共产生77763126条clean reads,其中每个样品的clean reads数为11.66M～15.02 M；每个文库的GC含量也均相一致(约为47%)。各样品与斑马鱼基因组map上的reads数为11 M-14.11 M之间,占总reads数的93.52%-94.3%,表明以NCBI斑马鱼基因组参考是合适的。zfSS1 MR组内与zfWT组内重复之间的皮尔逊相关系数(Pearson’s correlation coefficient)相近(R2=0.98, zfSS1M组的生物学重复之间的相关系数为(R2=0.973),这些结果表明了技术重复和生物学重复的高度可重复性。zfSS1MR组与zfWT组具有相似的基因表达水平变化趋势,而zfSSIM组的基因表达水平与这两组相比则大幅变化,表现为上调和下调。对于有生物学重复的实验,由于DESeq已经消除了生物学变异,则对差异基因筛选的标准一般只为padj<0.05。zfSS1M组较zfWT相比有935个基因呈现显著的差异表达,其中上调334,下调601。而zfSS1MR组较zfWT相比只有1个差异表达的基因,这说明营救组的胚胎基因表达与对照组近似。但值得注意的是zfSS1MR组较zfSS1M组相比有1086个基因差异表达显著,其中上调691个基因,下调395个基因,说明营救组与敲降组的基因差异显著的同时,又和敲降组与对照组间的差异基因有所区别。由此可见,营救的同时连带影响了除敲降带来的差异表达之外的基因的差异表达。这需要筛选zfSS1M vs zfWT的差异基因与zfSS1MR vs zfSS1M的差异基因的交集,也就是敲降后的差异基因与营救后的差异基因的共同的基因,这部分共同的基因即营救成功的基因。zfSS1M vs zfWT与zfSS1MR vs zfSS1M有705个基因,说明zfSS1M组与zfWT的935个差异基因,有705个营救成功。表达谱测序分析结果如下：(1)ss1基因敲降后引起胰岛素诱导的蛋白家族(insigl),胰岛素样生长因子Ⅱb(igf2b)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF binding proteins)的表达显著上调,经过SS1 mRNA营救后这些基因恢复到与对照组无显著差异的表达水平,与SS1表达呈负相关。GH/IGF轴及其信号成分是促进动物生长发育调节网络的中心。本研究结果显示,SS1通过负调控作用,抑制GH/IGF轴的促生长作用。Ss1敲降导致促甲状腺素释放素(trh)-基因表达明显上调,TRH主要促进甲状腺素的释放,甲状腺素主要促进骨骼、脑和生殖器官的生长发育。甲状腺激素又是是垂体分泌GH的主要调节因子,本研究结果表明,ss1还可以通过抑制trh的表达,间接调节GH的分泌。(2)本实验ss1敲降后,胚胎表型表现为大脑分室模糊,发育不良,经过表达谱分析发现转录因子Pou3f1显著下调,经过SS1 mRNA营救后恢复与对照组相当的表达水平,Pou3fl转录因子引发外胚层一个区域的干细胞变成神经前体细胞,从而生成神经外胚层。这些神经前体细胞然后继续分化形成神经元和神经胶质细胞,然后最终形成大脑和神经系统,提示SS1可能通过正调POU Ⅲ基因家族的表达在斑马鱼大脑和神经系统形成时起作用。Ss1敲降后导致转录因子soxl9a、soxl9b、sox21b、sox12明显下调,经过SS1 mRNA营救后这些基因又恢复到与对照组相当的表达水平。sox19a、sox19b这两个SoxB1成员具有促使神经元分化的功能。对于神经发生的另一个要求是Sox21的诱导,Sox21属于SoxB2组并且极像SoxB1蛋白质, Sox21可能通过竞争性结合共同的靶基因来阻碍SoxB1蛋白质的抗神经源性活性。从一个NEP细胞到一个成神经细胞的转变还由SoxC转录因子诱导,soxl2作为SoxC转录因子在中枢神经系统的功能中起到一定作用。SS1敲降后导致sox19a、sox19b、sox21b和sox12显著下调,说明sS1与SOX转录因子表达正相关,在神经元分化中起到作用。(3)SS1敲降后导致转录因子foxo3b显著上调,SS1 mRNA营救后该基因恢复到与对照组相当的表达水平。而FoxO作为Fox转录因子家族的亚家族能够起到G1期阻滞、G2期延迟、DNA修复以及凋亡诱导的作用,还能抑制肿瘤细胞的增长。ss1敲降后导致胚胎发育缺陷,可能与Fox转录因子有关,提示ss1与Fox转录因子共同维持胚胎发育、细胞周期进程、凋亡诱导和新陈代谢。综上所述,在斑马鱼胚胎发育时期,SS1通过直接方式对GH/IGF轴进行负调节参与斑马鱼胚胎发育的调控,此外,SS1还通过下调促甲状腺素释放激素基因(trh)的表达间接对GH促生长作用进行负调节；SS1可能通过正调节pou、sox转录因子基因家族的表达在斑马鱼大脑、神经系统形成和神经元分化时起调节作用；SS1可能通过负调节作用于fox家族几个转录因子表达,共同维持胚胎发育、细胞周期进程、凋亡诱导和新陈代谢。