干腌火腿是我国著名的传统肉制品之一,需要经历较长的成熟阶段。适宜的环境因子为丝状真菌生长繁殖提供优良条件,它们可能分泌各种真菌毒素,对人或动物致癌、致突变。低温腌制、中温脱水、高温发酵的自然加工方式一直沿用至今。所以对真菌毒素的安全防控是目前火腿行业面临的重要问题。真菌毒素的生物合成往往受环境因素影响。本文以检测成熟过程干腌火腿真菌毒素残留为研究起点,通过传统培养、高通量测序、宏基因组学及转录组学等手段,模拟火腿高盐发酵体系探究丝状真菌OTA生物合成机制及潜在的渗透胁迫调控因子,为科学指导传统火腿现代化生产,消除或降低真菌毒素积累提供理论依据。主要研究结果和结论如下:(1)建立了干腌火腿的黄曲霉毒素B1(AFB1)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、桔青霉素(CIT)、环匹阿尼酸(CPA)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、赭曲霉毒素A(OTA)、杂色曲霉素(ST)等9种真菌毒素的QTrap-LC-MS/MS检测方法。在优化条件下,9种真菌毒素在各自的线性响应范围内线性关系良好,相关系数(r)均不小于0.994。在低、中、高三个加标水平下平均回收率为74.5～103.4%,RSD在3.2～14.3%。LOD为0.1～2.5μg/kg,LOQ为0.5～10.0μg/kg。OTA污染严重,外层样品检出率7/25,含量在3.73～128.32 μg/kg;内层样品检出率3/25,含量4.23～24.38 μg/kg,少量试样检出CIT和CPA。AFB1,AFB2,AFG1,AFG2,DON均未检出。干腌火腿中OTA的积累与理化性质存在一定的相关性。(2)基于HiSeq高通量测序、宏基因组学解析菌落结构,次级代谢通路及其相关基因功能。鉴定得到的真菌种类归属于2个门,7个纲,11个目,16个科和17个属。发酵前期,Penicillium、Debaryomyces是优势菌群,而发酵中后期Aspergillus占主导。通过RDA分析可知,真菌群落变化与环境因子显著相关。通过宏基因组学测序信息比对KEGG pathway数据库,解析真菌毒素合成相关通路并进行功能注释。共挖掘Unigene 112个,编码蛋白33种,参与代谢酶14种,Pathway Entry 20条,KO代谢节点10个。(3)从25条干腌火腿中分离215个菌株,通过ELISA和HPLC筛选潜在产生菌,结果表明,共有22个菌株(占10.23%)能够产生OTA。重点考察7株高产菌,经形态学观察和ITS分子鉴定,分别确认为 A.ochraceus H1905,A.steynii H1611,A.subramanianii H2307,A.westerdijkiae H1409,P.brevicompactum H1 016,P.chrysogenum H0808,P.verruculosum H1118。(4)研究了温度、NaCl、aw等环境因子对真菌生理及代谢的影响,菌株产孢的最适温度为20～30℃,最适aw为0.95～0.97。曲霉菌偏好温暖的环境,产孢量与aw呈负相关且组间显著性差异(p<0.05)。当aw0.85、NaCl 10%时,P.verruculosum H1118 OTA积累量达320.7 μg/kg,而其他曲霉菌则产毒量较少。(5)考察 P.verruculosum H1118 和 A.subramanianii H2307对NaCl胁迫应答,运用RNA-Seq技术挖掘OTA生物合成的转录调控因子。高NaCl(80g/L)和低NaCl(8g/L)胁迫两个菌株,分别鉴定出1120、1074个差异表达基因。经GO富集分析,H1118PvH组参与次级代谢物合成、碳水化合物代谢、氨基酸代谢、MAP激酶磷酸化等基因上调,这将有利于OTA生物合成。经KEGG分析,NaCl胁迫下H1118PvMAPK信号通路中有15个上调基因,3个下调基因。而H2307 As分别仅发现2个和8个,差异表达基因都集中在Sln1-Ypd-Ssk1 支路,另三条支路 Sho1-Ste11、Hkr/Msb-Cdc42、Opy2-Ste50 未发现。NaCl胁迫使 H1118 Pv pks、nrps、chl、cyp、pal 等OTA合成基因上调,H2307 As关键产毒基因pks、nrps、chl却明显下调。基于RNA-Seq转录组分析,H1118Pv组氨酸/天冬氨酸激酶Sln1、组氨酸激酶Ypd1、天冬氨酸激酶Ssk1、MAPK激酶Pbs2、Hog1的编码基因均有上调,将激活Hog1发生磷酸化进而调控产毒基因的表达。Hog1是潜在的转录因子,这与H1118 Pv耐受NaCl胁迫的产毒机制密切相关。