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目的:
研究假基因Cripto-3在人大肠癌发生发展中的作用及机制探讨。
方法:
(1)收集36例住院病人的大肠癌组织标本,包括大肠癌组织和远端正常大肠组织,并记录下患者的临床病理资料。运用实时荧光定量PCR法检测组织标本中Cr-3mRNA的表达量。
(2)构建Cr-3基因的真核表达质粒转染人大肠癌HCT-116细胞,应用Cr-3小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)转染人大肠癌SW620细胞,分别采用MTT实验和平板克隆形成实验检测大肠癌细胞增殖能力,Transwell法检测大肠癌细胞的侵袭能力。
结果:
(1)实时荧光定量PCR法结果显示:在36例大肠癌组织中Cr-3高表达有27例(75.0%),而正常组织Cr-3基因mRNA表达极低,差异有统计学意义,(P<0.0001),并结合临床病理资料分析发现,Cr-3mRNA高表达与浆膜层侵袭、淋巴结转移和Dukes分期有关,差异有统计学意义(P均<0.05),而与患者性别、肿瘤发生部位和分化程度无关(P均>0.05)。
(2)在Cr-3真核表达质粒转染HCT-116细胞后,MTT结果显示:24h和48h时,3组细胞生长情况两两比较,差异无统计学意义(P>0.05);72h时Con-A组、Con-B组和Cr-3组相对增殖率分别为0.761±0.026、0.764±0.034和0.848±0.008(P<0.05);Cr-3组分别与Con-A组、Con-B组比较,细胞增殖能力明显增加(尸均<0.05);而Con-A组与Con-B组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。平板克隆形成实验结果显示:Con-A组、Con-B组和Cr-3组癌细胞克隆数分别为75±4、76±6和119±3(P<0.05);Cr-3分别与Con-A组、Con-B组比较,细胞克隆形成数明显增高,差异有统计学意义(P均<0.05);而Con-A组与Con-B组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Transwell实验结果显示:Con-A组、Con-B组和Cr-3组穿膜细胞数分别为44±4、45±5和76±6(P<0.05);Cr-3组分别与Con-A组、Con-B组比较,穿过滤膜的细胞明显增高,差异有统计学意义(P均<0.05);而Con-A组与Con-B组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
(3)在Cr-3siRNA转染大肠癌SW620细胞后,MTT方法检测结果为:24h和48h时,3组细胞生长两两比较,差异无统计学意义(P>0.05);72h后,Con-A组、Con-B组和siRNA组相对增殖率分别为0.927±0.037、0.922±0.035和0.663±0.018(P<0.05);Cr-3siRNA转染组分别与Con-A组、Con-B组比较,细胞增殖能力明显下降,差异有统计学意义(P均<0.05);而Con-A组与Con-B组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。平板克隆形成实验结果显示,Con-A组、Con-B组和Cr-3siRNA转染组分别为56±3、53±4和12±3(P<0.05);Cr-3siRNA转染组分别与Con-A组、Con-B组比较,克隆形成数明显下降,差异有统计学意义(P均<0.05);而Con-A组与Con-B组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。Transwell实验结果显示:Con-A组、Con-B组和Cr-3siRNA组穿膜细胞数分别为38±4、40±3和8±1(P<0.05),Cr-3siRNA转染组分别与Con-A组、Con-B组比较,穿膜细胞数明显下降,差异有统计学意义(P均<0.05);而Con-A组与Con-B组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。
结论:
本研究显示相对正常大肠组织,Cripto-3在大肠癌组织中表达上调,Cr-3mRNA的高表达与浆膜层侵袭、淋巴结转移和Dukes分期有关。Cripto-3真核表达质粒转染大肠癌HCT-116细胞后,显著增加了HCT-116细胞的增殖及侵袭能力。靶向沉默Cripto-3后,显著抑制了大肠癌SW620细胞增殖及侵袭能力。假基因Cripto-3在大肠癌发生发展中起到了重要的作用,它有望成为大肠癌临床诊断的一个检测指标,同时可能是大肠癌治疗过程中的一个重要靶点。