目的:视网膜母细胞瘤(RB)是婴幼儿最常见的恶性肿瘤之一，并且转移性视网膜母细胞瘤患儿的死亡率大概是90％。相对于发达国家，发展中国家视网膜母细胞瘤患儿的生存率要低得多，问题主要原因就是在发展中国家，这类肿瘤的早期发现、诊断率很低，而且有效治疗视网膜母细胞瘤的资源有限，又不能积极有效地防治系统性化学治疗引起的全身性毒副作用。因此，减轻视网膜母细胞瘤全身性化疗引起的副作用已成为现阶段科学研究的重点，从而可以改善、提高该病治疗的效果。目前在抗癌药物的研究中，相对依从性好的中医中药已越来越受到重视，传统医学已成为肿瘤治疗领域的一大特色。　　 传统中药三氧化二砷(ATO)能通过多种路径诱发急性早幼粒细胞白血病肿瘤细胞的凋亡和髓细胞的分化，而有效地治疗急性早幼粒细胞白血病，控制病情。通过临床观察，砷化合物能够完全缓解该病的临床症状，同时又没有骨髓抑制等情况发生，不伴有其他严重的毒副作用。研究证实ATO主要通过产生活性氧和激活caspase家族而诱导肿瘤细胞凋亡而发挥作用，但其具体的作用机理尚未完全明确。即使这样，近年来ATO也被越来越多地由单纯治疗血液系统肿瘤引申到实体瘤的治疗上，并取得了可喜的成果。越来越多的实验表明ATO应该可以通过发挥其生物学作用而有效治疗视网膜母细胞瘤，如调控细胞增殖、分化、凋亡等等。凋亡是肿瘤细胞死亡的一个重要方式，也是各种放疗、化疗药物治疗恶性肿瘤疾病的主要的生物学途径。而且，有报道显示在治疗视网膜母细胞瘤时，可以通过高剂量的ATO提高肿瘤细胞的凋亡率，但是其作用机制尚不清楚。　　 microRNAs(miRNAs)是一种大小约22nt的，内源性的小RNA，具有广泛的生物学作用。研究发现miRNAs与细胞的生长繁殖等密切相关，且具有很强的组织和生理学特异性，因此，miRNA的异常表达往往可以导致疾病的发生。大约共有1000个miRNA编码人类基因，并且这些miRNAs调控着大约60％哺乳动物的基因表达等。miRNAs不仅有明确的抑癌功能，也有致癌作用，尤其对于肿瘤的发展、转移和扩散的影响巨大。有研究在视网膜母细胞瘤细胞中发现了let-7b miRNA异常表达，同时其靶基因的表达也被观察到类似的现象。因此，研究ATO诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡过程中异常表达的miRNAs将是非常有意义的。　　 本课题拟研究ATO作用视网膜母细胞瘤细胞后显著差异表达的miRNAs，寻找其诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡过程中调控的靶基因及作用机制，使其有可能成为视网膜母细胞瘤治疗的新的切入点;这对于发现基因治疗视网膜母细胞瘤新的药物靶点具有重要意义，也为进一步在动物水平干预、寻找视网膜母细胞瘤基因治疗的新方法提供重要实验依据。　　 方法:　　 1.HXO-RB44细胞的培养、凋亡检测　　 用含10％胎牛血清(Gibco BRL，Rockville，MD)、1％双抗溶液(Invitrogen，Carlsbad，CA)的RPMI-1640培养液常规培养HXO-RB44细胞株，培养条件为37℃，5％ CO2饱和浓度，95％湿度;Annexin V/PI双染色后流式细胞仪分析。　　 2.MiRNA-microarray、Real-time PCR验证　　 4μM ATO处理72小时后收集RB细胞HXO-RB44，Trizol法抽提RNA，部分由LC Sciences公司负责进行microarray分析。取1μg RNA按照M-MLV逆转录酶说明书操作，使用设计好的miRNAs特异性反转录引物。该引物是针对不同的miRNAs设计的特异性茎-环逆转录引物。应用SYBR Green染料的荧光标记法的Real-timequantitative PCR检测最初模板DNA中特定miRNA的含量。并设计特异性PCR引物。GAPDH管家基因做内参。　　 3.MiRNA转染HXO-RB44细胞　　 HXO-RB44细胞用DMEM无血清培养基常规培养，当细胞密度达到2×104个/cm2时进行miRNA转染实验。miR-376a mimic是双链RNA，其序列与miR-376a相同;miRNA inhibitor则属于单链RNA，并且其序列与miR-376a互补;同时设转染试剂对照组和阴性对照组。　　 4.荧光报告基因检测分析　　 荧光报告基因检测是初步确立miRNAs对靶基因调控作用的常用方法，将caspase-3mRNA的3非翻译区(3UTR)片段的pGL3重组报告基因载体分别与空白对照pSuper质粒或pSuper-miR376a质粒共转染RB细胞，转染24小时后，收集细胞，利用双荧光报告基因检测系统检测荧光素酶报告基因的相对活性。　　 5.Western blot检测　　 取指数生长期的人视网膜母细胞瘤细胞HXO-RB44用RIPA试剂冰上裂解并抽提蛋白质;按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书操作测定蛋白浓度;取20μg完成抽提的蛋白行10％SDS-PAGE电泳，NC膜转膜;含5％脱脂奶粉的TBST室温封闭;抗原抗体反应:加抗caspase-3抗体及内参照抗体（GAPDH抗体），孵育，TBS洗;加辣根过化物酶标记的兔抗鼠二抗孵育，TBS洗膜;GeneGnome Bio图像分析系统测量不同条带的光密度值，定量分析结果。以GAPDH蛋白印记作为内参对照。　　 结果:　　 1.Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测凋亡:　　 对照组及在0.5，1，2，4，8μM不同浓度的的ATO作用于HXO-RB44细胞72h后，其平均凋亡率分别为5.9±0.7％，10.2±1.1％，22.5±2.4％，42.6±4.3％，44.1±4.5％，有明显的上升趋势，说明随着药物作用时间的延长，细胞凋亡比率上升。4μM可诱导明显凋亡，浓度又不会太高。　　 2.ATO诱导RB细胞凋亡的miRNAs表达谱:　　 MiRNA微阵列分析显示ATO诱导RB细胞凋亡过程中的一系列miRNAs发生了明显改变，其中miR-376a，-491-3p，-220b，-524-5p和let7b显著下调，miR-125a-3p,-943,-649,-890,-628-3p,-425,-129-5p,-34a和-181b显著上调。特别值得注意的是miR-376a的表达改变最为显著。　　 3.miR-376a对RB细胞凋亡的影响:　　 在常规培养的RB细胞，空白对照组凋亡率为4.8±1.2％，mock组（转染试剂对照组）凋亡率为4.8±1.2％，而转染miR-376a inhibitor使RB细胞低表达miR-376a后，凋亡率显著上升，达到31.2±5.4％。转染miR-376a mimic使RB细胞高表达miR-376a后，可显著降低ATO诱导的RB细胞凋亡;反之，转染miR-376a inhibitor使RB细胞低表达miR-376a后，可显著升高ATO诱导的RB细胞凋亡。　　 4.miR-376a靶基因的预测与分析:　　 通过TargetScan、Pictar、MiRanda、MiRBase和BibiServ软件对miR-376a潜在的靶基因进行预测。生物信息学方法分析发现，caspase-3的3’非编码区存在miR-376a的作用位点，其种子序列匹配较好，且相互作用的序列在物种间具有高度保守性，提示caspase-3可能是miR-376a的靶基因。双荧光报告基因检测系统检测说明miR376a可以作用于caspase-3 mRNA的3’非翻译区抑制重组荧光素酶报告基因的表达。miR-376a高表达或低表达后caspase-3 mRNA水平无明显改变，而caspase-3蛋白水平分别出现显著下降和升高的变化，说明miR-376a确实可以在转录后水平调控caspase-3的表达。ATO诱导后miR-376a表达下降，caspase-3蛋白表达水平升高，促进细胞凋亡的发生。　　 结论:　　 1.三氧化二砷能够抑制体外培养的人视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞的增殖，并诱导HXO-RB44细胞的凋亡，细胞凋亡率与药物的作用时间及剂量相关。　　 2.三氧化二砷通过异常表达的miRNAs诱导RB细胞的凋亡，其中miR-376a的表达改变最为显著。caspase-3是miR-376a的靶基因，且miR-376a在转录后水平调控caspase-3蛋白的表达。　　 3.三氧化二砷通过下调miR-376a的表达，引起其靶基因caspase-3表达增加，从而诱导视网膜母细胞瘤细胞的凋亡。