论文部分内容阅读
目的:卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一,预后较差,死亡率高居妇科恶性肿瘤首位。目前,卵巢癌肿瘤减灭术联合化疗是卵巢癌治疗的首选。众所周知,耐药是导致卵巢癌患者复发及死亡的重要原因之一。近年来研究表明,肿瘤微环境为肿瘤细胞耐药及免疫逃逸提供了良好的环境。因此,靶向肿瘤免疫微环境是肿瘤治疗的新兴研究方向。本研究旨在讨论巨噬细胞及受miR-21调控的巨噬细胞对卵巢癌细胞耐药性的影响,及其潜在的下游分子机制,即miR-21是否能够通过调控巨噬细胞极化,进而调节与巨噬细胞共培养的卵巢癌细胞中PI3K/AKT信号通路的表达以调控卵巢癌细胞的耐药性。研究方法:首先,根据GEO dataset数据库中的数据,通过CIBERSORT算法分析卵巢癌微环境中22种浸润免疫细胞的表达水平。之后,通过TCGA数据库中卵巢癌样本的临床病理数据,分析其与不同表型巨噬细胞的相关性,并根据Kalpan-Meier算法分析不同表型巨噬细胞的相对表达与卵巢癌患者预后的关系。根据GEO dataset数据库中的数据分析miR-21的表达水平与卵巢癌细胞耐药性,以及不同表型巨噬细胞相对表达的关系。通过real-time PCR方法检测miR-21在人卵巢癌组织中的表达水平,并通过TCGA数据库分析其表达与临床病理参数之间的相关性。培养人单核细胞系THP-1、人卵巢癌细胞系OVCAR3及HO-8910用于实验。PMA诱导THP-1细胞向M0型巨噬细胞转化,LPS及IFN-γ诱导M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化,而IL-4及IL-13诱导M0型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化。应用real-time PCR及流式细胞术检测不同表型的巨噬细胞表面标记物的表达。将M0型、M1型及M2型巨噬细胞与卵巢癌细胞共培养,检测其对卵巢癌细胞耐药性的影响。Real-time PCR检测卵巢癌细胞及巨噬细胞中miR-21的表达水平。将M0型、M1型及M2型巨噬细胞与卵巢癌细胞共培养,检测共培养后卵巢癌细胞中miR-21的表达。将转染miR-21 mimic及miR-21inhibitor的M2型巨噬细胞与卵巢癌细胞共培养,通过CCK8测定卵巢癌细胞的IC50,western blot方法检测卵巢癌细胞的耐药及凋亡相关指标cleaved caspase 3、BCL-2、ABCG2以及MDR1的表达,流式细胞术检测经处理后的卵巢癌细胞的凋亡能力及细胞周期水平。此外,通过real-time PCR方法检测转染miR-21 mimic及miR-21 inhibitor的M2型巨噬细胞中巨噬细胞相关标记物的表达水平。通过GSEA软件分析M2型巨噬细胞影响卵巢癌细胞耐药性的相关信号通路。Western blot方法检测与经miR-21处理的M2型巨噬细胞共培养的卵巢癌细胞中PI3K、AKT、p-AKT相关下游蛋白的表达变化。LY294002作为选择性PI3K抑制剂,用于行下游PI3K/AKT信号通路的挽救实验。结果:通过CIBERSORT算法分析,卵巢癌敏感及卵巢癌耐药组织中免疫细胞的表达差异明显,其中巨噬细胞在卵巢癌组织中相对表达量较高,而且M2型巨噬细胞在卵巢癌耐药组织中表达升高。此外,根据TCGA数据库中卵巢癌的预后数据分析显示,高表达M1型巨噬细胞的卵巢癌患者总生存期较长,而高表达M2型巨噬细胞的卵巢癌患者的总生存期较短,预后差。通过生物信息学分析结果提示,相对于卵巢癌敏感细胞,miR-21在卵巢癌耐药细胞中表达明显升高,并且相比于M0型及M1型巨噬细胞,miR-21在M2型巨噬细胞中表达量明显升高。根据我们收集的组织样本分析,相对于良性的卵巢组织,miR-21在卵巢癌组织中的表达明显升高。根据TCGA数据库中临床病理参数分析结果显示,miR-21的表达与卵巢癌组织学分级及淋巴结侵袭转移密切相关。Real-time PCR结果表明相比于卵巢癌细胞、M0型及M1型巨噬细胞,miR-21在M2型巨噬细胞中表达明显升高,同时将卵巢癌细胞与M2型巨噬细胞共培养使得卵巢癌细胞中miR-21的表达明显升高。CCK8及western blot结果提示与M2型巨噬细胞共培养的卵巢癌细胞显示出更强的耐药性。将M2型巨噬细胞转染miR-21 mimic并与卵巢癌细胞共培养可增强卵巢癌细胞的耐药性、抑制卵巢癌细胞凋亡、调控其细胞周期;而转染miR-21 inhibitor则会表现出相反的生物学行为。此外,在巨噬细胞中转染miR-21 mimic促进巨噬细胞向M2型巨噬细胞方向转化,而转染miR-21inhibitor则促进巨噬细胞向M1型巨噬细胞方向转化。通过GSEA软件分析表明,PI3K/AKT信号通路参与M2型巨噬细胞对卵巢癌细胞耐药性的影响,通过western blot方法分析,转染miR-21的M2型巨噬细胞可进而调控卵巢癌细胞中PI3K、p-AKT、AKT信号通路蛋白的表达以调控卵巢癌细胞的耐药性。通过LY294002预处理卵巢癌细胞1h,CCK8及western blot结果提示,经miR-21处理的M2型巨噬细胞是通过影响卵巢癌细胞中PI3K/AKT信号通路影响卵巢癌细胞的耐药性的。结论:1、卵巢癌耐药组织及卵巢癌敏感组织中免疫细胞表达水平差异明显,其中,耐药组织中M2型巨噬细胞的相对表达量较高。2、高表达M1型巨噬细胞的卵巢癌患者预后较好;而高表达的M2型巨噬细胞的卵巢癌患者预后较差。3、相比于良性卵巢组织,miR-21在卵巢癌组织中高表达,并且与卵巢癌组织学分级及淋巴结侵袭转移关系密切。4、M2型巨噬细胞与卵巢癌细胞共培养可促进其耐药,转染miR-21 mimic的M2型巨噬细胞与卵巢癌细胞共培养可促进其耐药、抑制癌细胞凋亡并促进细胞周期的S期阻滞,而转染miR-21 inhibitor则显示出相反的生物学行为。5、在巨噬细胞中转染miR-21 mimic可促进其向M2型巨噬细胞转化,而转染miR-21 inhibitor可促进巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化。6、与M2型巨噬细胞、经miR-21处理的M2型巨噬细胞共培养的卵巢癌细胞是通过调控PI3K/AKT信号通路来促进卵巢癌细胞的耐药性。