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随着组学技术和生物信息方法的进步,植物基因组学研究取得了快速的发展。柑橘作为最重要的果树作物之一,基因组学平台不断完善。在此基础上,对控制重要性状基因的遗传定位、基因发掘和变异机制研究已成为柑橘领域的研究热点。本研究对代表原始、野生和栽培柑橘进行比较基因组学和群体基因组学分析,解析了柑橘进化过程中的选择和变异。综合使用对遗传群体的集群分离分析法测序（BSA-seq）和自然群体局部区域关联分析方法,对控制柑橘珠心多胚位点进行了遗传定位,通过继代保存的夏橙愈伤材料间的比较,解析了离体无性系变异对体细胞胚胎发生能力的影响。对琯溪蜜柚色泽芽变材料使用基因组、转录组整合分析,进行柑橘色泽芽变特点和规律的研究。主要研究结果如下:1.原始、野生和栽培柑橘的比较基因组和群体基因组分析（1）本实验室在此课题前已完成了酒饼簕、宜昌橙、枸橼和柚四个柑橘基因组的从头组装和注释,再结合已发表的甜橙和克里曼丁橘两个基因组,用于柑橘比较基因组分析。酒饼簕属于原始柑橘,此外的五个柑橘属于真正柑橘组。其中,宜昌橙是野生柑橘,枸橼、柚、甜橙和克里曼丁橘都是现代栽培柑橘。通过基因组序列比较发现真正柑橘组的柑橘物种的基因组大小变化不大,但是酒饼簕和真正柑橘组物种的基因组大小相差很大。根据存在/缺失变异（Presence-absence variation,PAV）分析,柚相对于酒饼簕的特异片段中的基因显著富集于抗性反应、蛋白质水解和果胶酶裂解活性类别,而酒饼簕相对于柚的特异片段有较基因组水平（43.55%）更高的转座子（Transposable element,TE）含量（54.20%）。（2）针对六个柑橘基因组共有的8551个单拷贝同源基因,计算了非同义替换率/同义替换率的比值（dN/dS）。在酒饼簕中,12.79%的单拷贝同源基因的dN/dS值大于1,明显高于其余柑橘中的均值6.82%,这说明酒饼簕相对于其余柑橘基因组的序列分歧度最高,并且这些基因可能与酒饼簕独特的生物学特性有关。（3）由108份代表柑橘材料（包括酒饼簕、宜昌橙、枸橼、柚、橘和橙）组成的自然群体用于柑橘多态性和遗传差异分析,不同类别群体间的固定系数(FST)在0.28左右波动,为中等水平遗传分化程度;序列多态性（π）分析表明酒饼簕群体有最高的遗传多态性,宜昌橙群体比柚群体的多态性更高,并且从酒饼簕到宜昌橙存在剧烈的遗传多态性下降的过程;相对于原始柑橘,栽培柑橘中的生殖和能量代谢相关的基因受到了选择作用,如调控开花时间的FPA基因和WUSCHEL相关的同源异型盒WOX基因。2.柑橘多胚基因的遗传定位及离体培养体胚发生能力的研究（1）对单胚的HB柚和多胚的Fairchild橘的杂交群体构建极端池并进行混池测序（BSA-seq）,将柑橘多胚位点定位到4号染色体上的23.695Mb至25.655Mb的区间内。利用108个材料组成的自然群体（包括45个多胚材料和63个单胚材料）进行上述区间内的关联分析,将柑橘多胚基因锁定到4号染色体上的24.54Mb至24.62Mb的一段80kb的区间内,该区间包含11个编码基因,并且相对于单胚柑橘,多胚柑橘在该区段存在进化选择信号。此外,完成开发了一个用于鉴别柑橘单/多胚表型的共显性InDel标记。（2）以离体愈伤组织为材料,研究在经历长期离体培养过程后体细胞胚胎发生能力下降的分子基础,转录组分析表明长期离体培养后显著下调表达的基因显著富集在与胁迫应答和细胞壁合成相关的类别,同时发现基因区域的CHG型甲基化对转录水平存在负调控作用。（3）长期离体培养的愈伤与新诱导愈伤比较,体胚发生能力下降,检测出了在差异甲基化的区域中且差异表达的基因,其中9个基因功能注释与体胚发生能力有关。对12个甜橙植株不同组织/时期、离体愈伤材料的转录组进行权重基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）,检测出了147个在新诱导愈伤中特异表达的核心基因,其中与体胚发生相关的基因也存在差异的DNA甲基化,如编码胚胎发育晚期丰富蛋白的LEA基因和编码内切葡聚糖酶的KOR基因。3.柚色泽芽变材料的分析和柚红肉色泽位点的全基因组关联分析（1）对于琯溪蜜柚色泽突变体的六个不同组织层（叶片,花,果实的有色层、白皮层、囊衣、汁胞）分别进行SNP分析,检测到同一植株中不同组织的基因型不完全一致的位点,体现了芽变材料的基因组嵌合现象。（2）琯溪蜜柚红肉突变体（红肉蜜柚）果肉中富含番茄红素,橙肉突变体（黄金蜜柚）果肉中富含β-胡萝卜素,但整体类胡萝卜素合成途径上基因的表达水平变化并不显著,除NCED2在红肉和橙肉柚中出现更高表达。红肉突变体和橙肉突变体中上调表达的基因均富集在氧化还原酶活性、电子载体活性、血红素结合相关的类别中,并且橙肉与白肉柚的比较中,上调表达的基因还富集在与转运子活性和营养储藏活性的类别中。（3）琯溪蜜柚红肉突变体和橙肉突变体中DNA的拷贝数保持稳定。红肉琯溪蜜柚相对于白肉琯溪蜜柚的高置信度的SNV为1413个,SNV发生的频率约为4.086×10-6 SNV/bp。这些SNV所处的基因中有13个基因在红肉和白肉琯溪蜜柚中表现出显著的差异表达。橙肉琯溪蜜柚相对于白肉琯溪蜜柚的高置信度的SNV为2019个,SNV发生的频率约为5.839×10-6 SNV/bp。这些SNV所处的基因中有17个基因在橙肉和白肉琯溪蜜柚中表现出显著的差异表达。（4）由191个代表性的柚材料组成的群体用于GWAS分析,用于定位柚果肉红色相关的位点,显著关联到7号染色体上两个位点,以及在9号染色体和2号染色体上各一个位点。综上所述,本研究进一步丰富了柑橘基因组平台,基于柑橘遗传背景结合关联分析优化了精细定位的方法,成功定位了柑橘多胚性状的关联位点以及果肉性状的候选位点,为柑橘其他重要农艺性状的遗传定位提供参考,提供了多组学整合分析对柑橘体细胞变异的挖掘流程。