实验目的:外周循环血液中的循环肿瘤细胞在肿瘤的转移和复发中起着非常重要的作用。一般认为循环肿瘤细胞在肿瘤的原位点脱落,在血液循环中生存,当找到合适的生长位点时即可粘附,并形成微小的转移灶。越来越多的文献报道循环肿瘤细胞具有肿瘤干细胞的某些特征,尤其是在高级别肿瘤中这一情况更加的明显。这也就提示循环肿瘤细胞与肿瘤转移和复发存在着极为密切的关系。同时有研究指出循环肿瘤细胞具有“自我注射”的能力,即其可以再次回归肿瘤的初发位置激起肿瘤的再发展,并使其更具有侵袭性。所以及时的发现循环肿瘤细胞对观察与评估肿瘤患者的预后至关重要。但仅仅是发现循环肿瘤细胞并不能从根本上解决肿瘤转移和复发的问题,因此本研究主要是想通过一种简单易行的方法,分离循环肿瘤细胞,并通过免疫学手段初步找到循环肿瘤细胞在免疫学治疗中的应用价值。实验内容:本课题主要由四部分组成:第一部分,由于既往的研究和在肿瘤免疫学治疗过程中发现肿瘤患者外周血中存在有循环肿瘤细胞,我们在其中选取了60名曾在血涂片中发现循环肿瘤细胞或高度怀疑存在有循环肿瘤细胞的肾透明细胞癌患者,从2008年3月开始至2014年3月份,跟踪,观察其生存情况;第二部分,尝试分离、培养,并通过加入细胞因子和改变血清浓度等方式,希望找到一个循环肿瘤细胞的初步优化培养条件;第三部分,通过对培养的循环肿瘤细胞进行持续的观察,获得其形态学变化特征;第四部分,为了能更清楚的了解循环肿瘤细胞在肿瘤免疫学治疗中的应用前景,我们用已经培养成功的循环肿瘤细胞和肾透明细胞癌患者的原代培养细胞及肿瘤细胞系裂解物致敏DC后,与T淋巴细胞共培养,观察T细胞增殖的情况,然后按一定效靶比与CIK细胞或T淋巴细胞共培养,杀伤对应的循环肿瘤细胞,以观察其生物学功能与杀伤活性。实验方法:1.筛查60名肾细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞,持续跟踪,调查他们的生存情况。2.对确认有循环肿瘤细胞并且数目较多的患者分离提取30ml单个核细胞,进行循环肿瘤细胞的培养,并尝试加入细胞因子rh EGF 0、5、10、20、50μg/ml或改变培养基中血清的浓度10、15、20%等措施,希望初步找到循环肿瘤细胞的最优培养条件。3.持续观察循环肿瘤细胞的生长情况,并进行电镜检测。4.分离、培养相应患者的外周血T淋巴细胞、树突状细胞和CIK细胞。制备循环肿瘤细胞裂解物,通过DC-T和DC-CIK两种方案检测其免疫原性。实验结果:1.经过对上述60例患者进一步筛查循环肿瘤细胞发现有循环肿瘤细胞的患者23例,其中CTCs≥3的14例,CTC<3的9例,通过Spss19.0的Kaplan-Meiers法绘制两者的生存曲线,Log rank法分析两者并没有统计学的差异(P=0.152);将上述病人按有无循环肿瘤细胞分为两组(CTCs≥1和CTCs<1)后,经Kaplan-Meiers法绘制两者的生存曲线,Log rank法分析两者存在有统计学的差异(P=0.027)。2.经过对培养循环肿瘤细胞条件的初步优化,发现含20μg/ml的rh EGF和20%胎牛血清RPMI-1640培养基,最适宜其生长。3.通过扫描电镜观察,长时间培养的循环肿瘤细胞形成分化不完全的肾小管结构,呈典型的肿瘤性肾小管样结构。4.CTCs抗原可以有效地刺激T淋巴细胞的增殖,有效地激起DCT细胞和DC-CIK对循环肿瘤细胞和原代培养肿瘤的杀伤。实验结论:1.循环肿瘤细胞作为一个有价值的生物标志物可用于肾细胞癌患者的预后判断。2.循环肿瘤细胞能够于体外成功培养,20%rh EGF和20μg/ml FBS的加入有利于循环肿瘤细胞的体外增殖与生长。3.体外培养的肾细胞癌患者来源的CTCs具备肿瘤干细胞的特性。4.循环肿瘤细胞有独特的抗原活性,可诱导产生特异性的抗肿瘤干细胞的免疫反应。