论文部分内容阅读
目的:研究过度自噬(Excessive autophagy)对白介素-33(Interleukin-33,IL-33)在急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)中促炎作用的调控作用。方法:1.收集正常健康对照者和临床ARDS患者的血浆标本,用ELISA的方法检测其中IL-33的表达量,用细胞因子磁珠分选法检测其中TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6和IL-10表达量。2.将20只雄性C57BL/6 WT小鼠随机分成4组,分别是空白对照组(N组),脂多糖处理组(LPS组)、脂多糖+雷帕霉素预处理组(RAPA组)、脂多糖+3-甲基腺嘌呤预处理组(3-MA组),n=5/组。采用气管滴注LPS的方式来制备急性肺损伤模型。在LPS组小鼠气管滴注含LPS的PBS制备肺损伤模型。在手术前30分钟,按体重比例给予RAPA组小鼠腹腔注射雷帕霉素4mg/kg,按体重比例给予3-MA组小鼠腹腔注射3-甲基腺嘌呤15mg/kg。于术后24小时观察小鼠的一般情况;取小鼠血液、肺组织及肺泡灌洗液标本;HE染色并在显微镜下观察记录其形态学变化,评估小鼠肺组织的损伤程度;免疫组化与qRT-PCR检测小鼠肺组织中IL-33蛋白和mRNA的表达情况;免疫荧光及qRT-PCR检测小鼠肺组织中NF-κB的表达情况;western-blot检测小鼠肺组织中LC3和P62表达情况;ELISA方法检测小鼠血清与肺泡灌洗液中IL-33表达,细胞因子磁珠分选方法检测CXCL-1、TNF-α、IL-10、IL-13、IL-17A、IL-4、IL-6和CXCL-5水平的变化。结果:1.人血浆IL-33水平及其与其它细胞因子相关性ARDS患者血浆IL-33水平高于健康对照组(P<0.0001);相关性分析显示,ARDS患者血浆中IL-33与TNF-α、IL-1β、IL-2和IL-6呈正相关,与IL-10呈负相关。2.小鼠肺组织病理改变光镜下观察经HE染色的肺组织,LPS组、RAPA组和3-MA组小鼠肺组织均可见明显水肿、肺泡壁广泛增厚、肺泡塌陷、肺泡内出血和大量炎症细胞浸润。其中,3-MA组小鼠肺组织上述病理改变较LPS组明显减轻,RAPA组小鼠肺组织上述病理改变较LPS组加重,N组未见明显的肺损伤及炎症表现。3.小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-33水平变化与空白对照组相比,LPS组、RAPA组和3-MA组小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-33的水平均发生了不同程度的变化。与LPS组相比,在经过RAPA预处理后,小鼠血清及肺泡灌洗液当中IL-33的水平有所增加(P<0.0001,P<0.0001),经过3-MA预处理后,血清及肺泡灌洗液中IL-33水平稍增加,但低于LPS组水平(P<0.05,P<0.05)。4.小鼠肺组织中IL-33蛋白的表达与对照小鼠相比,LPS组、RAPA组及3-MA组小鼠肺组织中IL-33均有一定程度的增加。与LPS组相比,经过RAPA预处理之后的RAPA组小鼠肺组织中的IL-33蛋白水平增加,经过3-MA预处理之后的3-MA组小鼠肺组织中IL-33蛋白水平降低。5.小鼠肺组织中IL-33 mRNA的表达qRT-PCR数据显示,LPS组小鼠肺中IL-33 mRNA升高,3-MA组中mRNA的表达低于LPS组(P<0.001)。RAPA组肺组织中IL-33mRNA,高于LPS组(P<0.05)。6.小鼠血清和肺泡灌洗液中多种细胞因子水平的变化RAPA组小鼠血清以及肺泡灌洗液中CXCL-1、CXCL-5、TNF-α、IL-17A和IL-6的表达量增加,其表达量高于LPS组(p<0.001,p<0.05;p<0.05,p<0.05;p<0.01,p<0.05;p<0.0001,p<0.001;p<0.05,p<0.001)。3-MA组血清以及肺泡灌洗液中CXCL-1、CXCL-5、TNF-α、IL-17A、IL-6的表达量相对于LPS组有所下降(P<0.0001,p<0.01;p<0.0001,p<0.0001;p<0.0001,p<0.01;p<0.001,p<0.001;p<0.05,p<0.01)。RAPA组小鼠血清以及肺泡灌洗液中IL-10的表达量低于LPS组(P<0.05,p<0.0001),3-MA组小鼠血清以及肺泡灌洗液中IL-10的表达量高于LPS组(P<0.01,p<0.05)。LPS组、RAPA组、3-MA组小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-4和IL-13表达量无明显统计学差异。7.小鼠肺组织LC3-Ⅱ和P62的表达量变化与正常对照组相比,LPS组小鼠肺组织中LC3B-Ⅱ的表达量增加,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值增加。RAPA组小鼠肺组织中LC3-Ⅱ的表达量高于LPS组,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值增加。3-MA组小鼠肺组织中LC3-Ⅱ的表达量低于LPS组,LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值降低。RAPA组小鼠肺组织中P62的表达量低于LPS组,P62/actin比值降低,3-MA组小鼠肺组织中P62表达量高于LPS组,P62/actin比值升高。8.小鼠肺组织中NF-κB(P65)核转位变化气道滴注LPS之后小鼠肺组织NF-κB(P65)的核转位增加,LPS组的NF-κB(P65)的核转位高于正常组。与LPS组相比,RAPA组NF-κB(P65)的核转位水平增加。在3-MA组的NF-κB(P65)的核转位稍有增加,但与LPS组相比,其核转位水平较低。结论:过度自噬可影响小鼠急性肺损伤模型失控性炎症进程。过度加强的自噬能够加重小鼠肺部炎症,抑制自噬能减轻小鼠肺部炎症;过度自噬能调控小鼠急性肺损伤模型中IL-33的表达,其与NF-κB(P65)表达可能相关。