研究背景脑卒中是目前对人类危害最严重的疾病之一。脑卒中是高发病率、高致残率、高复发率、高死亡率、高经济负担的“五高”疾病。在我国,脑卒中是位列第一的死亡原因。免疫炎症在卒中的发生发展的病理发展过程中起重要作用。炎症是机体对刺激做出的一种防御反应,在生物体内起重要作用。当受到刺激因子的刺激时,会诱发炎症反应,从而修复组织,抵抗损伤。炎症也会对机体产生不良影响,导致免疫系统紊乱。已经知道炎症和免疫与卒中尤其是缺血性脑卒中的多种危险因素相关,包括高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、房颤、吸烟所致的血管损害等等。更为有趣的是脑血管病的事件导致了损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)的释放,从而增强了先天免疫反应,最后导致脑损害和有关的神经功能的缺失。目前公认的急性缺血性脑卒中的有效的治疗方法是在有效的时间窗内尽早恢复脑灌注,如临床上应用重组组织型纤溶酶原激活剂(recombinant tissue plasminogen activator, rTPA)进行超早期静脉溶栓,临床效果好,但是却受治疗时间窗、病人的一般情况及溶栓后容易并发出血等的各种并发症的多种因素的制约,所以只有大约不到20%的病人能获益,尽早恢复脑灌注在临床的实际治疗中存在困难。寻求有效的脑保护治疗成为多年研究的重点。几十年来大量的研究者专注于的细胞保护作用机制的研究,使脑细胞在缺血缺氧应激后仍能保持细胞内稳态的动态平衡,从而保护脑细胞不被破坏。实验在动物体内均获得很好的成效,但在临床转化研究中却均失败。尽管如此,在国际卒中组织的努力下,卒中的病理发展过程方面的研究仍有很大的进步。炎性小体(Inflammasomes)是一种多蛋白复合体,作为先天免疫的一部分可以在应激和感染等感受到外界信号刺激的情况下激活半胱天冬氨酸蛋白水解酶-1(caspase-1),从而产生白介素1β(IL-1β)和白介素18(IL-18)。Caspase-1和IL-1β增强炎症反应和细胞死亡,IL-1β在很多疾病包括脑缺血性损害过程中起重要作用,其机制尚未揭示。在卒中实验中,随着脑缺血的发生,IL-1β的表达增多,而且多个实验证实,阻止IL-1β的产生具有脑保护作用。值得注意的是人类的缺血性脑卒中血液和脑脊液中均可发现IL-1β的水平增高。在鼠模型中,脑缺血性损害后炎性小体相关蛋白水平增高,降低炎性小体相关蛋白水平可以减轻损害的程度。受损的细胞,包括神经细胞可以释放出三磷酸腺苷(ATP)、尿苷三磷酸(UTP),激活小胶质细胞或巨噬细胞上的离子通道P2X7受体,从而导致炎症因子前体的产生。Caspasel嵌合在大分子蛋-NLRP3上,在Caspasel的作用下,成熟的IL-1β、IL-18由其前体转化而来。缺血损害以及细胞的死亡导致了DAMPs的形成。DAMPs包括高迁移率族蛋白1(HMGB1)、热休克蛋白HSP60、A β,可以作用于细胞表面的Tool样受体(TLR),从而使炎性前体的基因表达增多。细胞因子的产生及补体的形成引起了白细胞浸润的增加,扩大了脑的损害,这样能产生更多的DAMPs,进一步加重损害。同时由损害细胞释放的抗原也激活T细胞介导的适应性的免疫。 这些近期的发展使得需要再评估炎症和免疫在卒中病理生理过程中的作用。2009年诺贝尔奖的获得者发现了染色体末端的端粒帽端粒帽能保护染色体防止其融合、降解和重组等,为衰老和癌症的研究奠定了基础。哺乳动物的端粒由TTAGGG碱基对组成,这些碱基对从死亡的宿主细胞中释放并且能减轻引起组织损害的炎症反应。合成的寡核苷酸A151是由四个TTAGGG碱基对结合在硫代磷酸酯骨架上构成。A151复制了端粒DNA调节炎症反应的能力,包括调节白介素6(IL-6)、白介素12(IL-12)、γ干扰素(IFNγ)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的产生。A151作为一种的抗炎症反应制剂,其治疗潜能已经在关节炎、内毒素休克、刀豆蛋白A诱导的暴发性肝炎、眼部炎症、狼疮肾炎、动脉粥样硬化和二氧化硅所致的肺部炎症等动物模型中得到证实。至关重要的是,硫代磷酸寡核苷酸的的药效学和安全性已经在多个临床试验中得到证实。A151对脑缺血后的炎症免疫反应的影响以及对脑缺血是否具有保护作用目前尚无人研究,基于IL-1β在脑缺血性损害中的作用以及A151成功改进多种疾病炎性因子的基础上,如果A151能减轻脑缺血后的炎症免疫反应,并对脑缺血损害具有保护作用,将为缺血性脑卒中的治疗提供新的亮点。脑缺血损害时,骨髓巨噬细胞和小胶质细胞是IL-1β的主要来源。脑缺血后,除了血管周围的巨噬细胞,单核细胞迅速渗入大脑也成为巨噬细胞。所以本实验选用骨髓巨噬细胞在细菌脂多糖(LPS)和糖氧剥夺(OGD)双重处理来模拟脑内缺血缺氧状态。易卒中自发性高血压大鼠(SHR-SP大鼠)生存期短,易发卒中,是研究脑卒中最为理想的动物模型。本实验采用SHR-SP大鼠的永久性大脑中动脉离断手术模型进行研究。本实验所应用的A151及对照剂寡核苷酸C151(5’-TTCAAATTCAAATTCAAATTCAAA-3’)由美国食品药物管理局(FDA)生物制品评价和研究中心(CBER)提供。目的1.体外部分：将骨髓巨噬细胞予以LPS和OGD的双重协同处理,以求模拟脑内的缺血缺氧的环境,检测A151在缺氧缺糖损害后的骨髓巨噬细胞的免疫炎症反应中的作用,能否减少炎性因子的释放,减轻炎症反应从而并减轻细胞的损害。2.体内部分：应用SHR-SP大鼠的永久性大脑中动脉离断手术模型,将从动物的行为、组织、免疫、基因等水平分别来观察A151对发生卒中后的SHR-SP大鼠的炎性因子的影响以及对脑组织的保护作用,观察其治疗潜能,以求进一步的脑保护作用。方法1.骨髓巨噬细胞的培养,取SHR-SP大鼠的股骨胫骨,冲洗骨髓腔,将得到的细胞悬液进行培养,并应用巨噬细胞特异性蛋白抗体染色,在荧光显微镜下确定99%以上的细胞都是BMDM细胞。2.应用A151、C151、LPS预处理骨髓巨噬细胞后,行OGD实验,18小时后收取上清及细胞留用。一部分上清用于做酶联免疫吸附测定((enzyme-linkedimmunosorbent assay, Elisa),一部分上清浓缩后测量蛋白浓度,和收集的裂解的细胞蛋白一起进行免疫印记实验(Western blot)。3.应用A151、C151、生理盐水分别预处理SHR-SP大鼠,对大鼠行永久性大脑中动脉离断手术,术后48小时进行神经功能评分,处死大鼠,收集脑、脾、肾血液等组织留用。4.收集的一部分大脑切片染色,应用Image J (NIH, Bethesda, MD)软件测量大鼠的脑梗死体积。5.一部分脑组织提取RNA,做Real-time PCR,检测脑中NLRP3、Aim2、NLRP4的mRNA的表达。6.收集的血液进行抗凝处理,一部分进行血液化学物质检测以及血细胞计数,另一部分离心后收集血浆进行酶联免疫检测。7.收集的一部分脑及脾组织裂解后测量蛋白浓度,做Western blot以及Elisa。8.应用JC-1试剂盒观察线粒体膜电位。结果1.A151能够明显减少细胞培养液上清中的IL-1β、IL-1 a、IL-6, CINC1和TNFY的水平,和对照组的ODN C151相比,C151只能减少IL-6、CINC1的水平,对其他因子没有影响。A151能够明显提高缺血缺氧状态下BMDM的存活率。这一结果也证实了其他研究者提出的A151在炎症细胞因子的中的作用并没有细胞毒性作用的说法。2.通过蛋白免疫印迹法来进一步检测A151在IL-1βB的成熟和表达中的作用。结果发现A151可以减少用OGD处理后的BMDM的培养液上清中的成熟的IL-1β的表达。而且A151减少了成熟的·aspasel和NLRP3以及iNOS的表达,但是A151对ASC, AIM2, NLRP1和NLRC4没有影响。3.线粒体功能障碍与NLRP3炎性小体的激活有关,本实验通过JC一1试剂盒检测发现A151能减轻线粒体膜的去极化从而减少细胞的死亡。4.在实验中应用永久性大脑中动脉离断手术模型研究A151的治疗潜能作用发现,与C151组和生理盐水组相比较,术前三天,术前一天以及术后三小时腹腔注射A151组的脑梗死体积均显著缩小,具有统计学意义。5.提取术后48小时后SHR-SP大鼠的脑组织的RNA,做Real-time PCR发现A151处理后的NLRP3的mRNA的表达明显减少,而Aim2和NLRP4的mRNA的表达无明显变化。结论1.A151减少LPS和OGD处理后的BMDM的死亡及炎性因子的释放。2.A151可以减少OGD和LPS的处理下的BMDM内的成熟的IL-1β和caspasel,并且能够减少NLRP3 and iNOS的表达。3.A151能减轻BMDM细胞的线粒体膜的去极化。4.A151可以减轻永久性大脑中动脉离断手术的SHR-SP大鼠的脑的缺血性损害。5.A151能减少永久性大脑中动脉离断手术的SHR-SP大鼠的脑内的NLRP3的mRNA的表达。