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第一部分:磷酸化 FoxO4(phosphorylated forkhead box subtype O4,p-FoxO4)参与 H9c2 细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤目的探讨p-FoxO4是否参与H9c2细胞H/R损伤。方法H9c2细胞正常培养24h后,均匀接种于6孔板中,密度为4.5*10^5个/ml,按照随机数字表法将其随机分为4组:对照组(Control组),H9c2细胞缺氧处理1h复氧1h(H1R1组),缺氧处理1h复氧3h(H1R3组),缺氧处理1h复氧6h(H1R6组)。四组采用CCK-8检测细胞相对存活率,实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)法检测FoxO4、Bim、Bcl-2和Bax的mRNA含量,确定最佳H/R时间点。对对照组和最佳H/R时间点组进行Hoechst染色检测细胞凋亡程度,JC-1法检测线粒体膜电位水平,Western Blot法检测FoxO4、p-FoxO4、Bim、Bcl-2和Bax的蛋白表达水平。结果与Control组相比,H/R处理后的H9c2细胞相对存活率明显降低,其中以H1R1组最为显著(P<0.01)。与Control组相比,H1R1组细胞凋亡率显著增加(P<0.01);线粒体膜电位降低,H1R1组FoxO4、Bim和Bax的mRNA明显升高(P<0.01),Bcl-2的mRNA明显下降(P<0.01);FoxO4、p-FoxO4和Bim及Bax蛋白水平明显升高(P<0.05;P<0.01;P<0.01;P<0.05),Bcl-2 的蛋白水平明显降低(P<0.01)。结论p-FoxO4促进细胞凋亡参与H9c2细胞的H/R损伤。第二部分:p-FoxO4通过调控Bim介导细胞凋亡参与H9c2细胞H/R损伤目的通过沉默FoxO4基因以及过表达Bim基因进一步探讨p-FoxO4-Bim信号介导细胞凋亡参与H9c2细胞H/R损伤的分子机制。方法H9c2细胞正常培养24h后,均匀接种于6孔板中,按照随机数字表法将其随机分为3组:缺氧/复氧组(H1R1组)、FoxO4沉默+缺氧/复氧组(FoxO4shRNA+H1R1组)、FoxO4 沉默和 Bim 过表达+缺氧/复氧组(FoxO4siRNA+Bim overexpressionRNA+H1R1 组,简称 shFoxO4+OB+H1R1 组)。各组采用 CCK-8 检测细胞相对存活率;Hoechst染色检测细胞凋亡程度;JC-1法检测线粒体膜电位水平;qPCR 法检测 FoxO4、Bim、Bcl-2 和 Bax 的 mRNA 含量;Western Blot 法检测 FoxO4、p-FoxO4、Bim、Bcl-2、Bax 的蛋白表达水平。结果与H1R1组相比,FoxO4shRNA+H1R1组的细胞相对存活率显著增加(P<0.01);凋亡率显著降低(P<0.01);线粒体膜电位显著改善(P<0.05);FoxO4、Bim 和 Bax 的 mRNA 显著降低,Bcl-2 的 mRNA 显著增加(P<0.01);FoxO4、p-FoxO4和Bim及Bax蛋白水平显著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白水平显著增高(P<0.05)。与FoxO4shRNA+H1R1组相比,shFoxO4+OB+H1R1组的细胞相对存活率显著降低(P<0.01),细胞凋亡率显著增加(P<0.01),线粒体膜电位显著下降(P<0.05),Bim和 Bax 的 mRNA 显著增高(P<0.01),Bcl-2 的 mRNA 显著降低(P<0.01)。Bim 和Bax的蛋白水平显著增高(P<0.01),Bcl-2的蛋白水平显著降低(P<0.01)。结论p-FoxO4调控Bim介导细胞凋亡参与H9c2细胞H/R损伤。