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1.研究目的：吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)是以周围神经组织脱髓鞘病变及炎性细胞浸润为病理特点的自身免疫性周围神经性疾病,临床表现为急性对称性弛缓性肢体瘫痪。实验性自身免疫性神经炎(experimental allergic neuritis, EAN)是T细胞介导的周围神经系统炎症性脱髓鞘疾病,因其与GBS具有相似的临床及病理特点而成为研究人类GBS的经典动物模型。在EAN的发病过程中,巨噬细胞作为一种经典的免疫细胞,参与了疾病的发生发展。近年来研究表明,巨噬细胞在EAN病理过程中主要表现为两种亚型：经典活化的M1亚型巨噬细胞及选择性活化的M2亚型巨噬细胞。M1型巨噬细胞具有促进炎症进展及较强的吞噬作用,而M2型巨噬细胞具有抑制炎症,促进组织重塑和修复作用。巨噬细胞由M1型向M2型转化的机制仍未十分明确。前列腺素(PG)作为疾病炎症过程中的非细胞介质参与EAN炎症的发生发展。尤其以前列腺素E2与前列腺素EP2及EP4受体相互作用的促炎性作用更为突出。已有研究证实,使用PGE2-EP4受体拮抗剂L161982可以促进包括EAE在内的自身免疫疾病的炎症恢复,减轻临床症状。本研究通过建立EAN大鼠模型,使用前列腺素E2-EP4受体拮抗剂L161982对EAN不同发病阶段进行干预,观察巨噬细胞M1及M2亚型在EAN不同发病阶段的比例变化及其相关细胞因子的表达变化,探讨PGE2-EP4信号通路对M1与M2亚型转化的影响,进一步探索促进EAN自发性恢复的机制。2.研究方法：2.1抗原制备采用高速离心法自新鲜的牛神经根提取周围神经髓磷脂(bovine peripheral nerve myelin, BPM)。将提取的BPM溶于含H37Ra热灭活结核菌的不完全弗氏佐剂中,边震荡混匀边加入等量生理盐水制成混悬液。其中,每100ul抗原乳剂含BPM5mg,结核杆菌lmg。2.2实验动物处理2.2.1建立EAN模型21只健康、清洁的6-8周(160-170g)龄雌性Lewis大鼠于SPF级实验室中适应性饲养1周。10%水合氯醛(0.3g/kg)麻醉大鼠,于大鼠双后足垫皮下注射制备好的抗原乳剂(每只200u1),制备EAN动物模型。2.2.2实验动物分组及药物干预将21只EAN大鼠随机分为A、B、C三组,其中将A组设为空白对照组。A组大鼠每日腹腔注射L161982溶媒(5mg/kg),B组大鼠自免疫前1天～免疫第8天(免疫阶段)每日腹腔注射L161982(5mg/kg)、C组大鼠自免疫第5～16天(发病期)每日腹腔注射L161982(5mg/kg)。2.3临床评分自免疫前1天开始每日对3组大鼠进行体重称量和临床评分,直至免疫第16天。临床评分标准如下：①0分：正常;②0.5分：全尾肌张力下降：③1.0分：尾部肌肉瘫,松软拖地;④1.5分：轻度后肢无力或肌张力降低;⑤2.0分：重度后肢无力或轻度后肢瘫;⑥2.5分：中度后肢瘫;⑦3.0分：严重后肢瘫;⑧4.0分：严重四肢瘫。2.4大鼠腹腔巨噬细胞提取于免疫第16天(发病高峰期)处死3组大鼠,于无菌实验台上,向大鼠腹腔注射10mlDMEM,静置5min后,打开大鼠腹腔,待肠管变扁时,用2ml无菌一次性吸管吸取腹腔灌洗液,置于离心管中。于离心机上离心后,去上清,留沉淀,制备单细胞悬液。对细胞进行计数,按照将细胞按2×106个/mL的密度接种于6孔板中,置于37℃,5%C02培养箱中。培养24h后换液,去掉未贴壁细胞,继续培养至第3天。2.5流式细胞术检测EAN大鼠腹腔巨噬细胞亚型比例3组大鼠腹腔巨噬细胞培养3天后,取6支流式管(编号为1、2、3、4、5、6),试管1～5每管中加入106个/mL巨噬细胞。试管6为空白对照。用PE标记的CD86抗体、Alexa Flour647标记的CD163抗体及抗兔CD68抗体及FITC标记荧光二抗等不同荧光抗体组合分别标记M1型巨噬细胞、M2型巨噬细胞及总巨噬细胞。试管1加入PE标记的CD86抗体,试管2加入Alexa Flour647标记的CD163抗体,试管3加入抗兔CD68抗体及FITC标记荧光二抗,试管4加入PE标记的CD86抗体、抗兔CD68抗体及FITC标记荧光二抗,试管5加入Alexa Flour647标记的CD163抗体、抗兔CD68抗体及FITC标记荧光二抗。试管6为空白对照。充分混匀后,置于室温暗处孵育30min后,各管加入2mLBSA进行洗涤,1500r/min离心5min后,弃上清。每管加入400 μ LPBS重悬,经细胞筛网过滤后,加入1%的多聚甲醛100μL固定,待上机检测。用流式细胞术检测3组大鼠两种巨噬细胞亚群比例。2.6 ELISA检测EAN大鼠脾单个核细胞培养上清细胞因子3组EAN大鼠脱颈处死后,无菌条件下摘取EAN大鼠脾脏,置于含5mlDMEM培养基的离心管中,将脾脏置于无菌实验台上剪碎后于细胞筛上研磨脾脏碎片,收集脾单个核细胞研磨液。置于离心管中,1200 rpm/min,离心5 min后弃上清并混匀。每管加入2 ml红细胞裂解液,于室温下静置5min后,待细胞悬液变为无色后,每管加入1ml胎牛血清终止破红。1200 rpm/min,离心5 min后弃上清,加入2mlDMEM培养基并混匀。充分混匀后用细胞计数板对细胞进行计数。将细胞按2×106个/mL的密度接种于6孔板中,置于37℃,5%CO2培养箱中。培养3天后,收集六孔板中细胞培养上清,置于2ml离心管中,3组大鼠单个核细胞培养3天后,取各组大鼠脾单个核细胞培养上清,用ELISA法检测3组大鼠脾单个核细胞培养上清液中IL-12及IL-10的含量。2.7统计学分析采用SPSS19.0软件,应用单因素方差分析(one—factor analysis of variance, ANOVA)比较3组间差异,两两比较采用LSD法,结果以均值±标准差(standard deviatio, SD)表示,P<0.05为差异有统计学意义。3.结果：3.1各组大鼠的发病情况和临床评分自免疫后第6天至第15天,各组大鼠均发生EAN症状。与A组比较,B组、C组发病时间均明显延迟(P<0.05),B组大鼠发病时间较C组明显延迟(P<0.05)；与A组比较,B组、C组发病高峰期临床评分明显降低(P<0.05);与C组比较,B组大鼠临床评分降低明显(P<0.05)。3.2流式细胞术检测3组大鼠巨噬细胞亚群比例A组相比,使用L161982治疗的B组、C组中,CD86+细胞占腹腔灌洗细胞的百分比明显降低(P<0.05),CD86+细胞占CD68+细胞的百分比明显降低,CD163+细胞占CD68+细胞的百分比明显升高(P<0.05)；与C组比较,B组中CD86+细胞占腹腔灌洗细胞的百分比降低更明显(P<0.05),CD86+细胞占CD68+细胞的百分比降低更明显(P<0.05),CD163+细胞占CD68+细胞的百分比升高更明显(P<0.05)。3.3 ELISA法检测3组大鼠脾单核细胞培养上清IL-12、IL-10的含量与A组相比,使用L161982治疗的B组、C组中,脾单核细胞培养上清中IL-12表达量明显降低(P<0.05),与C组相比,B组中IL-12的含量降低更明显(P<0.05)；与A组相比,B组、C组中IL-10的表达量明显升高(P<0.05),与C组相比,B组中IL-10的表达量升高更明显(P<0.05)。4.结论：4.1 L161982降低了EAN大鼠中M1型巨噬细胞占总巨噬细胞的比例,升高了M2型巨噬细胞占总巨噬细胞的比例,免疫阶段作用更明显。4.2 L161982抑制了Ml型巨噬细胞相关细胞因子IL-12的表达,促进了M2型巨噬细胞相关细胞因子IL-10的表达,免疫阶段作用更明显。4.3 L161982降低了EAN大鼠临床评分,延迟了EAN大鼠发病时间,免疫阶段作用更明显。