论文部分内容阅读
高传能线密度（LET）的重离子束辐射较低LET的X或γ射线诱导更为强烈的生物学效应。重离子束最主要的物理学特征是其具有倒转的深度剂量分布，即在其射程的末端出现高剂量的Bragg峰，而且重离子束在Bragg峰区表现出高的相对生物学效应（relative biological effectiveness，RBE）这一极其重要的生物学特征。将重离子束应用于放射治疗，会在高效杀灭靶区癌细胞的同时，最大程度地保护健康组织，因而将重离子束应用于放射治疗当中比常规低LET的X和γ射线具有不可比拟的优越性。正是如此，重离子束治癌成为当今放射治疗领域的前沿研究热点，而且重离子束也被誉为面向二十一世纪放疗用的最佳射线。Survivin是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor of apoptosis protein family，IAP）的一员，该蛋白在大多数恶性肿瘤中高表达，而在正常组织中检测不到，因此具有组织特异性。Survivin参与肿瘤细胞分化并抑制肿瘤细胞凋亡，它的高表达被证明与很多恶性肿瘤对放射治疗中产生辐射抗性相关。为了探讨重离子辐射后survivin表达与细胞辐射敏感性等生物学效应的关系及相关机制，本研究以人类肝癌细胞系SMMC-7721细胞为实验材料，经过survivin特异性siRNA转染，利用中国科学院近代物理研究所兰州重离子研究装置（HIRFL）提供的中能12C6+离子束辐射SMMC-7721细胞，研究了特异性survivin基因siRNA转染对12C6+离子束辐射SMMC-7721细胞相关生物学效应的影响，得到了一些重要的实验结果和基础数据。实验结果总结如下：1．重离子束辐射提高SMMC-7721细胞的辐射敏感性，改变细胞周期分布，高效诱导细胞凋亡使用12C6+离子束和X射线辐射SMMC-7721细胞，采用标准克隆形成法分析并绘制存活曲线；利用流式细胞技术（FCM）检测辐射后细胞周期分布及凋亡率。结果显示，SMMC-7721细胞对高LET重离子辐射较低LET X射线辐射更敏感，表现出更强的放射敏感性；高LET重离子辐射细胞后，细胞明显阻滞与G2／M期，细胞凋亡率增加，这种改变存在明显的剂量依赖关系。2．Survivin基因siRNA的应用极大提高SMMC-7721细胞对重离子束辐射的放射敏感性根据Genbank提供的survivin序列，合成特异性siRNA寡核苷酸探针，转染SMMC-7721细胞，使survivin基因瞬时表达。转染细胞接受12C6+离子束辐射后利用标准克隆分析得到SMMC-7721细胞对重离子束辐射的放射敏感性较单纯辐射更强。这说明survivin是SMMC-7721细胞产生辐射抗性的原因之一。3．siRNA技术与重离子束辐射抑制SMMC-7721细胞survivin基因的表达采用real-time PCR方法分析survivin基因在转录水平的表达，Western-Blot检测survivin蛋白表达。结果显示，经过siRNA转染的细胞，接受12C6+离子束辐射后，无论在转录水平还是翻译水平上，survivin表达均受到抑制。说明siRNA和重离子束辐射联合处理能有效抑制survivin基因的表达。4．Survivin siRNA提高了重离子束辐射对SMMC-7721细胞增殖活性的抑制能力应用MTT法分析联合处理后SMMC-7721细胞的增殖活性。联合处理能够有效的抑制SMMC-7721细胞的增殖活性，说明survivin基因在肿瘤细胞中能够协助肿瘤细胞通过畸形有丝分裂过程进入细胞分化过程，细胞增殖能力增强，当survivin基因敲除并联合重离子束辐射，增殖能力被去除，最终表现为细胞增殖活性下降。5．重离子束辐射使经过survivin siRNA转染的SMMC-7721细胞G2／M阻滞增强，细胞凋亡率增加利用流式细胞技术检测细胞周期分布，Annexin V实验检测细胞凋亡率。经过联合处理的SMMC-7721细胞G2／M阻滞较单纯辐射更明显，细胞凋亡率明显增加。Survivin基因siRNA转染SMMC-7721细胞，抵消了survivin抗凋亡作用，增强了细胞对重离子束辐射的放射敏感性，最终表现为更多辐射绌胞阻滞于辐射敏感时相——G2／M期，细胞凋亡率相应增加。以survivin基因为靶基因的siRNA技术应用于肝癌SMMC-7721细胞，可以极大提高该细胞系对重离子束辐射的放射敏感性，抑制细胞增殖活性，提高重离子束辐射诱导的G2／M阻滞及细胞凋亡。本论文研究为临床应用重离子束治疗癌症提供一定的理论和科学依据，同时也为重离子束放射治疗联合基因治疗提供了新的思路。