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目的:将乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)X蛋白真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx转染巨噬细胞,观察X蛋白在细胞中的表达及其对巨噬细胞分泌细胞因子及凋亡的影响,为进一步研究HBV的致病机制奠定实验基础。 方法:用Primer5.0软件分析HBV X基因序列,设计相应特异性引物,聚合酶链反应(PCR)扩增465bp的目的基因片段,将其插入pcDNA3.1(+)载体,通过双酶切分析及测序鉴定筛选阳性重组体;将真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx通过Super FectTM脂转染试剂转染巨噬细胞,利用 Western-blotting鉴定X蛋白在巨噬细胞中的表达;细胞转染质粒后24h,用LPS刺激巨噬细胞,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测pcDNA3.1(+)-HBx转染的巨噬细胞不同时间(12h、24h、48h)培养上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β的含量,统计软件SPSS13.0分析所得数据;通过形态学方法观察巨噬细胞,利用显微计数法测定X蛋白即时高表达时,地塞米松诱导的细胞凋亡并计算凋亡率,用统计软件通过方差分析所得数据。 结果: (1)将PCR扩增的465bp大小的HBV X基因片段,连接入pcDNA3.1(+),双酶切及测序结果表明X基因亚克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体,即得 X蛋白真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx。 (2)将真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx转染巨噬细胞,Western-blotting结果显示pcDNA3.1(+)-HBx能在巨噬细胞中表达约17KD的目的蛋白。 (3)ELISA法测定细胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量,LPS刺激组及pcDNA3.1(+)组与空白对照组有显著性差异(P<0.01),pcDNA3.1(+)-HBx组与LPS刺激组及pcDNA3.1(+)组有显著性差异(P<0.01),而LPS刺激组与pcDNA3.1(+)组无显著性差异(P>0.05),即LPS可活化巨噬细胞分泌细胞因子,且X蛋白即时高表达可引起LPS诱导的巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β明显增加。 (4)地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡所得数据进行方差分析,地塞米松刺激组及pcDNA3.1(+)组与空白对照组有显著性差异(P<0.05),pcDNA3.1(+)-HBx组与pcDNA3.1(+)组及地塞米松刺激组有显著性差异(P<0.05),而地塞米松刺激组与pcDNA3.1(+)组无显著性差异(P>0.05),即地塞米松能高效诱导巨噬细胞凋亡,且X蛋白即时高表达导致地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡率明显降低。 结论: (1)成功构建了HBV X基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-HBx,并能在巨噬细胞中表达HBV X蛋白。 (2)X蛋白即时高表达上调LPS刺激的巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β。 (3)X蛋白即时高表达抑制地塞米松诱导的巨噬细胞凋亡。