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本文以性成熟青年母猪和性成熟雌性大白鼠为研究对象，应用凝胶层析和磁珠免疫亲和层析法提取猪卵泡抑制素（IHN）纯品；用氯气法将获得的INH纯品与碘(125I)标记，制备INH放射标记物；应用微囊转运、体内颈静脉灌流和放射自显影等技术研究125I-IHN能否通过血脑屏障内皮细胞微囊；用免疫组化技术和荧光组化技术研究抑制素及其受体在垂体的定位；最后，用亲和层析方法将该受体提取出来，并进行分析，以期对抑制素的作用机制有一个全面的了解，主要内容如下： 1 猪卵泡抑制素的提取及其标记 本研究通过采集猪卵泡液，用70％饱和硫酸铵液沉淀蛋白质，然后用竞争ELISA法检测沉淀物中抑制素含量。将有抑制素活性的样品分别过Sephadex G-200柱（100cm×2.6cm）和Sephadex G-100柱（30cm×1.6cm），进行凝胶层析试验，最后应用磁珠免疫亲和层析法将获得的INH粗提物进一步纯化，使INH纯度从12.4ug.mg-1升至39.4ug.mg-1。在上面的实验中，用SDS-PAGE法检测提取物的纯度，最后应用PAGE电泳发现一条相对分子质量为32，000的条带，SDS-PAGE电泳发现有两条相对分子质量分别为14，000-15，000和17，000-18，000的带，分别为β、α亚基。这些结果证明，本研究获得了理想的INH纯品。 由于抑制素较容易失活，因此，本标记试验采用了较温和的氯气法将获得的INH进行了碘(125I)标记，结果其放化性质为放化纯度＞95％，标记率为85％，放射性强度为7.04×103Bq．s-1，比活性为4.3uci．ug-1，放射浓度为0.2uci．mL-1。 2 血脑屏障内皮细胞微囊转运卵泡抑制素 本研究分为两部分，即体外微囊转运试验和体内颈静脉灌流实验。 在体外微囊转运试验中以性成熟二花脸母猪与长白母猪为研究对象。首先制备了血脑屏障内皮细胞微囊。选性成熟二花脸母猪和长白母猪各5头，取大脑皮质，应用玻璃珠层析法制备微血管，然后用密度梯度离心法分离内皮细胞微囊，最后应用倒置显微镜和透射电镜观察微囊的完整性；通过测定γ-谷氨酰转肽酶、5′-核苷酸酶、乙酰胆碱酯酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶等标志酶活性来鉴定微囊的纯度和生物学活博士论文:血脑屏障内皮细胞微囊对卵泡抑制素转运的研究及其受体分析性.结果证明，用该方法分离得到的大脑皮层内皮细胞微囊完整性较好，纯度较高，生物学活性较好，适合于对血脑屏障转运实验研究. 将”，I一INH进行体外模型转运试验，即血脑屏障内皮细胞微囊转运试验.首先通过试验从血脑屏障内皮细胞微囊浓度、最适反应时间、离子通道、渗透压等角度分析影响血脑屏障内皮细胞微囊转运卵泡抑制素的因素，获得最适工作条件，建立体外转运方法。通过分析微囊摄取”，工一INH的动力学参数，发现微囊可通过钠离子依赖的主动转运模式摄取抑制素，摄取过程与溶液中的Na’和Ca”离子含量有关，二花脸猪和长白猪微囊摄取抑制素的K。值分别为0.17 Pmol.L一，和0.02 Pmol.L一‘，最大摄取速度V二。:值分别为1.15 pmol.min一‘.mg一，和2.27 pmol.min一，.mg一‘.这些结果证明，卵粱分泌的抑制素可以直接通过血脑屏障作用于垂体，二花脸猪产仔数高与血脑屏障对卵泡抑制素的通过量低有关。 在灌流试验中以性成熟SD雌性大鼠为研究对象。将20只SD大白鼠随机分为四组，每组5只，实验前用10%乌拉坦麻醉，实验组（1、2、3组）颈静脉注射’勺一INH50 ul，对照组（4组）注射同样量的生理盐水.1、2、3组分别于注射”，I一INH后30min、60 min和120 min断头，迅速取出垂体、下丘脑，用生理盐水洗涤一下，在Y-测量仪上记数1 min，将放射性最强的垂体组织及其相应的下丘脑组织和对照组的垂体和下丘脑放入10%中性甲醛固定液中固定12h。然后制作石蜡切片，在暗室中进行放射自显影试验.Y计数结果证明，第1组的放射性强度最高，放射性强度为1 008土5.78 Bq.s一‘，而第2、3组的垂体放射性强度分别为723土4.95 Bq.s一，、491士4.9Bq.s一，，这三组的T丘脑放射性强度为20土1.0 Bq.s一，、21.8土0.95 Bq.s一，与19士0.73 Bq.s一，.第四组（对照组）的垂体与下丘脑的放封性强度分别为16土1.4Bq.s一‘、15士0.98 Bq.s一‘.由此可见，在灌流30 min（第z组）时，垂体放射性强度最高，以后随着时间的延长，放射性强度逐渐降低（第2，3组），说明在灌流30 min时血脑屏障转运抑制素达饱和状态，此时抑制素透过率最高。此外，1，2，3组（实验组）的垂体的放射性强度与第4组（对照组）差异极显著（P<0.01），而下丘脑的放射性强度与第4组差异不显著（P>.05），而1，2，3组内部的垂体与下丘脑的放射性强度差极显著（P<0.01）。 放射自显影结果证实，试验组大鼠的腺垂体上有明显的银颗粒，而对照组没有;试验组和对照组大鼠的下丘脑均未见明显的银颗粒。这些结果进一步说明，抑制素能通过血脑屏障，并在垂体上有工NH结合位点或受体，而在下丘脑没有结合位点或受体。3大鼠垂体抑制素免疫组织化学定位 前面的试验结果表明，抑制素能通过血脑屏障与其作用位点或受体结合.为了证摘要实垂体本身能否分泌抑制素，并以旁分泌方式与其周围的受体或结合