论文部分内容阅读
研究目的：1建立健康人唾液中葛根素、栀子苷含量测定的间接竞争ELISA方法,对该方法进行适用性考察,为中药及其复方微量或痕量活性成分在人体唾液中药物浓度分析及药代动力学研究提供新方法与新思路。2研究不同剂量葛根素、栀子苷在健康志愿者唾液中的药代动力学特征,观察服药后不同时间唾液中药物浓度动态变化,为采用唾液进行临床人体药代动力学研究以及临床药物监测提供研究基础与科学依据。研究方法：1建立健康志愿者唾液中葛根素含量测定的间接竞争ELISA方法,制备标准曲线,并考察该方法的线性范围、灵敏度、最低检测限、精密度与准确性、相对回收率、稳定性以及葛根素单克隆抗体的特异性。分别用间接竞争ELISA方法和HPLC方法对唾液中葛根素含量进行测定,比较两种含量测定方法的相关性。2三组剂量葛根素在健康志愿者唾液中的药代动力学研究：30名健康志愿者随机分为3组,每组10人,清晨空腹口服葛根胶囊剂量分别为20mg/kg、40mg/kg和60mg/kg体重,各受试者于服药前30min收集空白唾液,服药后于15、30、50、60、70、80、90、100、110、125、140、155、170、240、300、360、420min收集唾液。唾液样品处理后,采用间接竞争ELISA方法检测唾液样品中葛根素的浓度,以葛根素浓度为横坐标(X轴),在450nm处的吸光度为纵坐标(Y轴),绘制标准曲线,并按标准曲线计算各时间点唾液样品中葛根素浓度,绘制唾液药物浓度-时间曲线。采用Kinetica version4.4软件求出药动学参数,以SPSS17.0软件统计参数,数据以_±s表示。3建立健康人唾液中栀子苷含量测定的间接竞争ELISA方法,制备标准曲线,并考察该方法的线性范围、精密度与准确性、相对回收率、稳定性以及栀子苷单克隆抗体的特异性。4初步探讨分析栀子苷唾液浓度与血液浓度的相关性：2名女性健康志愿者清晨空腹口服栀子胶囊剂量为12mg/kg体重。以服药开始为起点计时,按设定时间点同时收集唾液与血液样品。2名受试者于服药前30min收集空白唾液与空白血液,服药后于15、30、45、60、120min收集唾液与血液样品。唾液与血液样品经处理后,采用间接竞争ELISA方法检测唾液样品与血液样品中栀子苷的浓度,以栀子苷浓度为横坐标(X轴),在450nm处的吸光度为纵坐标(Y轴),绘制标准曲线,并按标准曲线计算各时间点唾液与血液样品中栀子苷浓度,绘制唾液与血液平均药物浓度-时间曲线。5两组剂量栀子苷在健康志愿者唾液中的药代动力学研究：12名健康志愿者随机分为2组,每组6人,清晨空腹口服栀子胶囊剂量分别为20mg/kg和12mg/kg体重,各受试者于服药前30min收集空白唾液,服药后于5、15、30、40、50、60、70、80、100、125、140、155、170、200、240、300、360、420min收集唾液。唾液样品处理后,采用间接竞争ELISA方法检测唾液样品中栀子苷的浓度,以栀子苷浓度为横坐标(X轴),在450nm处的吸光度为纵坐标(Y轴),绘制标准曲线,并按标准曲线计算各时间点唾液样品中栀子苷浓度,绘制唾液药物浓度-时间曲线。采用Kinetica version4.4软件求出药动学参数,以SPSS17.0软件统计参数,数据以X±s表示。结果：1葛根素在健康人唾液中的线性范围为5ng/ml-1280ng/ml,线性回归方程为y=-0.178ln(x)+1.4562, R2=0.9939,灵敏度(50%抑制时的浓度)为140ng/mL,最低检测限为2.47ng/ml,日内精密度和日问精密度的RSD值均小于15%,平均回收率范围为95%-115%,稳定性RSD值均小于15%,葛根素抗体除与黄芩素有51.8%的交叉反应外,与其余结构类似物均无明显交叉反应。唾液中葛根素含量测定的间接竞争ELISA方法与HPLC方法相关性良好,相关系数R2=0.9916。2三组剂量葛根素在健康志愿者唾液中的药代动力学参数：20mg/kg体重组Cmax=47.04±22.53ng/mL,Tmax=48.89±7.81min,AUC0-t=23844.10±13352.90ng/mL·min,T1/2=280.43±82.44，MRT=378.08±150.68min;40mg/kg体重组Cmax=90.85±66.56ng/ml32018.40±14502.25ng/mL·min,T1/2=191.91±78.70，MRT=333.10±121.11min;60mg/kg体重组：Cmax=152.55±78.45ng/mL, Tmax=49.00±11.01min, AUC0-t=41252.50±25224.71ng/mL·min, T1/2=173.78±75.24, MRT=311.49±95.42min。健康志愿者口服葛根胶囊之后,三组在0-10min内均可以检测出葛根素,三剂量组的葛根素唾液浓度-时间曲线均出现双峰现象,并且达峰时间第一次大约均为49min,第二次大约均为110mmin。三组剂量的唾液葛根素浓度-时间曲线趋势基本一致,但每组10名健康志愿者在相同时间点上唾液中葛根素含量都具有较大个体差异性。三组剂量Cmax与AUC0-t均有显著性差异(P<0.05),每组Cmax与AUC0-t随剂量增加而升高。Cmax和AUC。-。与剂量之间的相关性良好,唾液中葛根素呈线性药代动力学特征。3栀子苷在健康人唾液中的线性范围为0.78μm/mL-12.50μL，线性回归方程为y=-0.252In(x)+0.9937,R2=0.9972,日内精密度和日间精密度的RSD值均小于15%,平均回收率范围为80%-120%,稳定性RSD值均小于15%,栀子苷抗体与结构类似物均无明显交叉反应。4初步探讨分析栀子苷唾液浓度与血液浓度的相关性：2名女性健康志愿者清晨空腹口服栀子胶囊后,栀子苷唾液与血液平均浓度-时间曲线总体趋势基本一致,并且2名受试者在30min的唾液浓度与血液浓度均达到峰值。唾液浓度比血液浓度较低,栀子苷唾液浓度与血药浓度的S/P比值均小于1。对2名受试者的栀子苷唾液浓度与血液浓度相关性初步研究分析,结果显示R2=0.7953,表明栀子苷唾液浓度与血液浓度相关性较良好。5两组剂量栀子苷在健康志愿者唾液中的药代动力学参数：20mg/kg体重组：Cmax=31.93±8.12μg/mL,Tmax=56.67±12.11min, AUC0-t=21249.08±9332.28μg/mL-min, T1/2=433.66±188.26min, MRT=677.30±249.27min;12mg/kg体重组：Cmax=22.81±20.85μg/mL, Tmax=98.33±27.14min, AUC0-t=4794.65±2885.74μg/mL-min, T1/2=141.52±38.25min, MRT=285.26±47.66min。健康志愿者口服栀子胶囊之后,两组剂量的唾液栀子苷浓度-时间曲线均出现双峰现象,20mg/kg剂量组第一次达峰时间为约50min,第二次达峰时间约为155min；12mg/kg剂量组第一次达峰时间为约70min,第二次达峰时间约为140min。两组剂量的唾液栀子苷浓度-时间曲线趋势基本一致,但每组6名健康志愿者在相同时间点上唾液中栀子苷含量都具有较大个体差异性。两组剂量Cmax和AUC0-t均有显著性差异(P<0.05)。口服胶囊420min后,唾液中栀子苷浓度仍处于缓慢下降趋势,且MRT较长。结论：1基于酶联免疫吸附方法的快速、高效、高灵敏度和高特异性,本实验研究首次成功建立了葛根素、栀子苷在健康人唾液中的间接竞争ELISA方法,通过方法学考察,标准曲线线性范围良好,灵敏度高,精密度与准确性、相对回收率均符合人体生物样品的检测范围标准,并且唾液样品在处理、分析过程中具有稳定性,间接竞争ELISA方法真实、可靠,适用于人体唾液样品中葛根素、栀子苷微量成分的含量检测,为中药及其复方中微量或痕量活性成分在人体唾液中药物浓度分析及药代动力学研究提供新方法与新思路。2唾液是人体的重要体液之一,使用唾液分析检测药物含量具有无创性、操作简单易行等特点。本试验首次使用间接竞争ELISA方法检测葛根素、栀子苷在人体唾液中含量,研究不同剂量葛根素、栀子苷在健康志愿者唾液中的药代动力学,初步探讨分析栀子苷唾液浓度与血液浓度相关性。研究结果表明葛根素、栀子苷在人体唾液中的代谢特征与相关文献血液中代谢特征具有一定相关性,因此采用唾液进行临床药代动力学研究以及某些药物监测具有重要意义,为采用唾液进行临床人体药代动力学研究以及临床药物监测提供研究基础与科学依据,为临床用药确保一个安全、有效、合理的用药方案以提高生物利用度。