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缺血性脑卒中是导致患者神经功能障碍及肢体瘫痪的重要原因之一。尽管重组组织型纤溶酶原激活物(r-t PA)是一种有效的治疗方式,由于治疗时间窗较窄,只有3-5%病人能够接受并可能从中受益[1]。电针脑保护策略是我科提出的预防围术期脑缺血损伤的新策略,电针可以减轻动物MCAO后神经功能缺失及减少梗死面积[2]。我们前期研究发现,电针可增加缺血再灌注后脑内内源性大麻素AEA和2-AG含量,同时上调CB1R[3],调控RISK通路中(ERK、εPKC、GSK-3β、STAT3等功能分子的磷酸化水平)、抑制神经细胞凋亡,从而发挥脑保护作用[4-6]。此外,我们发现电针可以通过调节神经元胆碱能抗炎通路中α7n ACh R抑制HMGB1释放减轻脑缺血后神经炎症[7]。NLRP3炎症小体作为触发炎症反应的整合平台,主要由NLRP3、ASC和caspase 1前体组成[8]。当各种危险信号作用于细胞膜上TLRs受体后,激活了细胞内NF-κB通路,促进炎症小体蛋白和IL-1β、IL-18前体的合成;细胞内各种DAMPs刺激活化NLRP3炎症小体,切割活化procaspase1并促进IL-1β、IL-18成熟和释放,发挥促炎作用[9]。此外,caspase 1通过一种特殊的方式激活了细胞凋亡,导致神经元和胶质细胞的死亡[8]。综上所述,NLRP3炎症小体在启动固有免疫反应,caspase 1活化以及脑缺血后神经系统无菌性炎症反应中均发挥重要作用[10]。因此,本实验旨在探索电针是否通过神经元α7n ACh R调控炎症小体减轻脑缺血后神经炎症的作用及其机制,为电针脑保护作用提供了更多实验依据,并为电针向临床应用转化提供了坚实的理论基础。实验一脑缺血再灌注损伤对炎症小体表达的影响目的观察脑缺血再灌注损伤后不同时间点炎症小体表达的变化。方法雄性SD大鼠20只,随机分为假手术Sham组(n=4)、MCAO组(n=16)。其中MCAO组再随机分为四组(n=4),行大脑中动脉阻塞模型1.5小时后,分别于再灌注后的6h、24h、3d、7d处死,取同侧半暗带皮层组织,Western Blot检测炎症小体蛋白NLRP3、Cl.Caspase 1和Mature IL-1β的变化。结果与Sham组相比,NLRP3在MCAO后24h、3d、7d表达明显增高(Ρ<0.01),Cl.Caspase 1在MCAO后3d、7d表达增高(Ρ<0.01),Mature IL-1β含量在MCAO后6h、24h、3d、7d表达均明显增高(Ρ<0.01)。结论脑缺血再灌注损伤后不同时间点炎症小体表达逐渐升高,其中脑缺血再灌注后3d炎症小体表达量最高,因此我们选择3d这个时间点进行电针干预。实验二电针对脑缺血再灌注后NLRP3炎症小体介导的炎症反应的影响目的1.证实电针抑制了脑缺血再灌注后NLRP3炎症小体介导的炎症反应。2.探索电针是否调节了脑缺血再灌注后缺血半暗带区促炎因子和抗炎因子表达平衡。方法1.电针是否抑制脑缺血再灌注后NLRP3炎症小体介导的炎症反应雄性SD大鼠21只,随机分为假手术Sham组(n=7)、MCAO3d组(n=7)及电针EA+MCAO3d组(n=7)。其中MCAO3d组及EA+MCAO3d组,行大脑中动脉阻塞模型1.5小时后,分别于再灌注后3d取材。Western Blot检测炎症小体蛋白NLRP3、Cl.Caspase 1和Mature IL-1β的变化;免疫荧光染色检测NLRP3和Caspase 1表达变化情况。2.电针是否调节脑缺血再灌注后缺血半暗带区促炎因子和抗炎因子表达的平衡雄性SD大鼠24只,随机分为假手术Sham组(n=8)、MCAO3d组(n=8)及电针EA+MCAO3d组(n=8)。ELISA试剂盒检测促炎因子IL-18、TNF-α和抑炎因子TGF-β1、IL-10表达含量的变化。结果1.与MCAO3d组相比,电针降低了脑缺血再灌注后NLRP3、Cl.Caspase 1和Mature IL-1β表达含量(Ρ<0.01);作为Westernblot的佐证,免疫荧光染色同样证实了电针降低了脑缺血再灌注后神经元中NLRP3和Caspase 1免疫荧光强度。2.相比于MCAO3d组,电针降低了脑缺血再灌注后促炎因子IL-18和TNF-α表达含量(Ρ<0.05),同时升高了抗炎因子TGF-β1和IL-10表达含量(Ρ<0.01)。结论电针不仅抑制了脑缺血后NLRP3炎症小体介导的炎症反应,同时,调节了脑缺血后缺血半暗带区促炎因子和抗炎因子表达的平衡。实验三α7nAChR参与电针对NLRP3炎症小体的抑制并发挥脑保护作用目的证实α7n ACh R参与电针对NLRP3炎症小体的抑制并发挥脑保护作用。方法雄性SD大鼠112只,随机分为假手术Sham组、MCAO组、电针EA+MCAO组、α7n ACh R的抑制剂α-BGT组、α-BGT溶剂组、α7n ACh R的激动剂PHA-543,613组、PHA-543,613溶剂组(n=16)。脑缺血再灌注后3d,取半暗带组织Western Blot检测神经元中α7n ACh R表达含量和炎症小体蛋白NLRP3,Cl.Caspase 1和Mature IL-1β的表达变化(n=4),3d后评估神经行为学及脑梗死体积的大小(n=8),以及使用TUNEL染色观察凋亡阳性细胞数目(n=4)。结果1.与MCAO3d组相比,电针上调了脑缺血再灌注后α7nAChR表达含量(Ρ<0.01)。2.与EA+MCAO组相比,EA+α-BGT组上调了炎症小体蛋白NLRP3、Cl.Caspase1和Mature IL-1β的表达(Ρ<0.01);同时,EA+α-BGT组脑梗死体积百分比增加(Ρ<0.05),神经行为学评分降低(Ρ<0.01),而且TUNEL染色凋亡阳性细胞数目明显增加(Ρ<0.05)。3.与MCAO组相比,PHA-543,613不仅可降低脑梗死体积百分比(Ρ<0.01),改善神经行为学评分(Ρ<0.01),而且减少TUNEL染色凋亡阳性细胞数目(Ρ<0.01);同时,PHA-543,613组下调了炎症小体蛋白NLRP3、Cl.Caspase 1和Mature IL-1β的表达(Ρ<0.05)。结论1.电针增加了脑缺血再灌注后α7n ACh R表达含量。2.给予α7nAChR抑制剂α-BGT干预,可逆转电针对NLRP3炎症小体介导的炎症反应的抑制;同时α-BGT逆转了电针的脑保护作用。3.应用α7n ACh R的激动剂PHA-543,613干预,可诱导与电针相似的保护作用;同时,PHA-543,613抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应。综上所述,α7n ACh R参与电针对NLRP3炎症小体的抑制并发挥脑保护作用。小结本实验采用雄性SD大鼠MCAO模型,首先通过western-blot证实了脑缺血后不同时间点炎症小体表达逐渐升高,其中脑缺血后3d炎症小体表达量最高。随后,选择3d这个时间点进行电针干预,发现电针抑制了脑缺血后NLRP3炎症小体介导的炎症反应,同时调节了脑缺血后缺血半暗带区促炎因子和抗炎因子表达平衡。那么,电针抑制NLRP3炎症小体介导的炎症反应的机制是什么呢?针对这一问题,进一步实验选择了α7n ACh R抑制剂α-BGT和激动剂PHA-543,613进行干预,证实了α7n ACh R参与电针对NLRP3炎症小体的抑制并发挥脑保护作用。总之,本研究发现电针通过神经元α7n ACh R调控炎症小体,减轻脑缺血后神经炎症反应,并抑制细胞凋亡,发挥脑保护作用。这一研究结果为电针向临床转化提供更充分的依据。