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研究背景腹膜透析是终末期肾病重要的肾脏替代治疗方式之一,透析相关性腹膜纤维化导致的超滤衰竭已成为影响腹膜透析疗效,继而影响其预后的主要原因。腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT)是启动和维持腹膜纤维化的关键机制,TGF-β1在其中发挥关键作用。microRNA (miRNA, miR)是近年来发现的一组非编码小RNA,通过特异性识别下游靶基因mRNA的3’非翻译区(UTR)抑制其翻译,或直接降解mRNA,在多种生理过程中发挥重要作用。新近关于乳腺癌、糖尿病肾病的研究表明,miRNA是参与调控EMT的重要因素之一,可能与其影响转录因子及参与调节TGF-β1下游信号通路等机制有关。但在腹膜纤维化领域尚无文献报道。我们前期的研究首次发现,长期腹膜透析患者(>12个月)腹透液脱落细胞中miRNA 194表达明显上调,且与E-cadherin表达水平呈负相关,与a-SMA表达呈正相关,提示miRNA 194与腹膜间皮细胞EMT有一定相关性。但发生EMT时腹膜间皮细胞的miRNA表达谱改变及miRNA参与EMT调控的机制尚不清楚。基于以上分析,我们认为经TGF-β1诱导发生EMT的腹膜间皮细胞可出现miRNA表达谱的特征性改变,调节特定miRNA的表达水平可以抑制TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞EMT。第一章TGF-p1诱导人腹膜间皮细胞EMT及miRNA表达图谱分析目的分析经TGF-β1诱导发生EMT的腹膜间皮细胞miRNA表达图谱,筛查可能介导腹膜间皮细胞EMT的miRNA。方法常规培养腹膜间皮细胞,分对照组、TGF-β1刺激12h、24h、48h组。倒置显微镜观察各组细胞形态学变化；采用免疫荧光、Realtime PCR检测ZO-1、vimentin的表达,采用Realtime PCR、Westernblot检测E-cadherin mRNA和蛋白的表达。应用基因芯片法筛查对照组和TGF-p,刺激48h组腹膜间皮细胞miRNA表达图谱并进行差异分析。应用软件预测miRNA下游靶基因,筛查可能参与介导腹膜间皮细胞EMT的miRNA,并以Realtime PCR验证目的miRNA在对照组和TGF-β1刺激24h组腹膜间皮细胞的表达,分别计算2-ΔΔCT值。结果TGF-β1诱导腹膜间皮细胞形态出现成纤维细胞样改变,TGF-β1刺激后腹膜间皮细胞ZO-1、E-cadherin表达显著下调,vimentin表达明显七调,呈时间依赖性,与对照组比较有显著性差异,TGF-β1成功诱导腹膜间皮细胞发生EMT。基因芯片法筛查发现TGF-β1诱导48h后腹膜间皮细胞miRNA表达图谱出现特征性改变,hsa-miRPlus-E 1114、hsa-miRPlus-E1245表达上调,hsa-miR-589、hsa-miR-505*、hsa-miRPlus-F1147、hsa-miRPlus-E1033、hsa-miR-337-5p、hsa-miR-513a-5p、hsa-miRPlus-E1075、hsa-miR-891a、hsa-miR-1260、hsa-miR-1280、hsa-let-7e、hsa-miR-1255a表达下调。经软件预测靶基因,miR-589、miR-1260下游靶基因中均包括Ets-1(E-cadherin抑制转录子SIP1的上游调节因子)。选择miRNA589为研究对象,Realtime PCR结果提示,设对照组2-ΔΔCT值为1,TGF-p1刺激24h组miRNA589的2-ΔΔCT值为0.6992±0.0924(p<0.01).结论TGF-β1可成功诱导腹膜间皮细胞发生EMT,同时miRNA表达图谱发生特征性改变。分析各miRNA表达量及预测下游靶基因,其中miR-589可能参与TGF-β1诱导的EMT调控。第二章miRNA-589介导人腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化的分子机制目的探讨miRNA589对体外人腹膜间皮细胞株(HPMC)EMT的影响及分子机制。方法常规培养HPMC细胞,分为对照组(无血清DMEM/F12培养)、TGF-β1组(TGF-β15ng/m1诱导24h)、TGF-β1+pre-miR-589组(pre-miR-589预转染HPMC后以TGF-β15ng/ml诱导24h)。采用Realtime PCR检测miRNA589:应用Realtime PCR.Western blot分别检测E-cadherin、ZO-1、vimentin、Ets-1 mRNA和蛋白的表达；应用Realtime PCR检测SIP1 mRNA的表达。结果1.Realtime PCR结果显示,与对照组相比,TGF-β1组miRNA589水平明显下调rGF-β1+pre-miR-589组miRNA589表达则较TGF-β1组显著上调(p<0.01),而与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。2. Realtime PCR与Western blot结果显示与对照组相比,TGF-β1组vimentin mRNA和蛋白表达水平均明显上调,而E-cadherin、ZO-1 mRNA和蛋白表达水平均明显下调,以上改变在pre-miR-589+TGF-β1组均被抑制,均有统计学意义。3. Realtime PCR结果显示,TGF-β1组Ets-1 mRNA表达水平明显上调,与对照组相比有显著性差异(p<0.01),pre-miR-589+TGF-β1组Ets-1 mRNA表达水平较TGF-β1组有所下降,但无显著性差异(p>0.05); Western blot结果显示TGF-β1组Ets-1蛋白表达水平较对照组显著上调p<0.01),pre-miR-589+TGF-β1组Ets-1蛋白表达水平较TGF-β1组明显下调(p<0.05),而与对照组相比无显著性差异(p>0.05)。Realtime PCR结果还证实,与对照组比较,TGF-β1组Ets-1下游的SIP1 mRNA表达上调,该作用可被pre-miR-589抑制。结论miRNA589是调控TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞EMT的重要分子,其机制可能与通过Ets-1影响E-cadherin转录有关；上调miRNA589水平可以抑制TGF-β1诱导的腹膜间皮细胞EMT。