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柿(Diospyros kaki Thunb.;2n=6x=90)原产中国,是柿属植物中最具经济价值的栽培种,我国柿栽培面积和产量均居世界第一。但传统产区多为完全涩柿(PCA),需人工脱涩方能食用;而完全甜柿(PCNA)在树上可自然脱涩,且其果实货架期较长,更具商品价值,是未来柿育种的重要目标。已经明确,中国原产完全甜柿(简称“中国甜柿”或C-PCNA)自然脱涩性状受显性单基因位点控制,因而在完全甜柿的遗传改良中具有重大应用潜力。前期研究表明,中国甜柿自然脱涩可能涉及可溶性单宁的自然凝固过程,但其机理尚不完全清楚。本文以中国甜柿为试材,首先利用SSAP技术构建温水脱涩差异表达cDNA文库,获得中国甜柿温水脱涩过程中与“凝固效应”相关的候选差异基因片段,同时结合非完全甜柿(non-PCNA)对温水脱涩机理进行初步探讨;其次,基于cDNA-SSAP文库筛选参与中国甜柿的自然脱涩的差异转录片段,通过RACE及染色体步移获取其cDNA全长,并利用柿叶片瞬时超表达技术对候选基因功能验证;最后,应用酵母单杂交系统筛选与脱涩基因互作的候选转录因子,进一步探讨中国甜柿自然脱涩的调控机理。本研究为中国甜柿可溶性单宁自然凝固的分子机理以及甜柿遗传改良研究提供科学依据。主要研究结果如下:1.应用cDNA-SSAP技术构建中国甜柿温水脱涩前后差异转录的cDNA文库,经qRT-PCR分析及转录组数据库比对确认了文库数据的可靠性及准确性。cDNA文库包含差异转录条带283条,Blast2GO分析显示其主要参与单宁合成、跨膜转运、糖酵解和果胶代谢等不同的生物学过程。2.醛类介导的“凝固效应”及果胶的累积是柿果温水脱涩的主要原因。基于差异表达cDNA文库新发现3条参与醛类代谢候选基因片段,1条参与果胶代谢的差异转录片段,qRT-PCR分析显示其在中国甜柿和非完全甜柿温水脱涩过程中均上调表达。结合单宁及水溶性果胶含量测定,结果表明醛类及果胶的累积是柿果温水脱涩主要原因。3.基于cDNA-SSAP文库,筛选得到参与中国甜柿自然脱涩的候选基因片段TDF 284-2(PK基因)(转录条带;transcript-derived fragment;TDF),利用RACE及Walking技术首次在柿属植物上分离获得6条DkPK的cDNA全长。4.DkPK1潜在参与中国甜柿的自然脱涩。分析6条DkPK基因在不同脱涩类型柿果实发育过程中的表达模式及其与可溶性单宁的关系,结果表明DkPK1表达变化与中国甜柿可溶性单宁含量呈高度负相关;聚类分析及亚细胞定位显示其为细胞质PK,潜在参与调控及醛类的代谢。瞬时超表达DkPK1可显著降低柿叶片中可溶性单宁含量,同时显著上调其下游醛类代谢关键基因DkPDC1,3,4,5和DkADH1,3表达量。由此推测DkPK1的上调表达可促进可溶性单宁的“凝固”进而导致中国甜柿的自然脱涩,并提出中国甜柿自然脱涩分子机制模型图。5.分离得到4个DkPK1的上游调控因子。基于DkPK1全长序列信息,通过染色体步移分离得到2,000 bp左右的启动子序列。应用酵母单杂交技术从酵母文库中筛选分离140个目的单克隆,最终获得4个与DkPK1互作的上游调控因子,分别为MADS-Box、WRKY、MYB和YABBY类转录因子。此外,利用同样方法分离得到3个与已知基因DkCAD1互作的候选转录因子。综上所述,基于SSAP技术,我们构建了中国甜柿柿果温水脱涩前后差异表达cDNA文库,结合对非完全甜柿的分析,初步阐明乙醛介导的“凝固效应”及果胶-单宁复合物的形成是导致柿果温水脱涩主要原因;分离鉴定6个DkPK基因,初步确定DkPK1参与了中国甜柿的自然脱涩;最后,通过酵母单杂交技术在酵母文库中分离4个调控DkPK1的候选转录因子,其中3个转录因子在柿中系首次报道。中国甜柿自然脱涩相关基因及转录因子的获取,为甜柿自然脱涩调控机理研究和未来完全甜柿新种质的创造提供科学依据并奠定分子育种技术基础。