缺血性脑血管病是临床上最常见的神经系统疾病，具有高致残率和高致死率，因此，对缺血性脑损伤相关机制的研究，将对脑血管病的防治具有重要意义。近年来，信号转导在神经系统疾病的的发生、发展中的研究已受到广泛关注，其中Notch通路参与缺血脑损伤机制的研究正日益受到重视，已有研究表明Notch信号可调控动脉生成、参与缺血脑损伤后神经元新生过程。Notch信号是一个在进化过程中高度保守的信号转导通路，存在于无脊椎动物和脊椎动物的多个物种之中，在生物体发育过程中决定细胞的命运，Notch信号转导通路通过“旁分泌”作用于临近细胞，在神经元、血管内皮细胞发育过程中间接调节细胞分化，其中调控细胞增殖、分化和凋亡的功能涉及几乎所有组织和器官，但Notch信号如何参与缺血性脑损伤过程及其机制尚不清楚，因此，深入研究Notch信号通路在脑缺血损伤中的作用及其机制，进一步揭示Notch信号转导通路与脑缺血损伤的联系和内在机制，可能为脑缺血损伤的治疗提供理论依据。本研究的创新性在于首次采用体外实验，探讨了Notch信号通路在脑缺血损伤中早期作用及其分子机制，为Notch信号通路在脑缺血损伤中的机制研究奠定了实验基础，研究结果表明，Notch信号通路可能成为脑缺血损伤机制研究和脑缺血损伤早期治疗的新靶点。1. PC12细胞氧糖剥夺模型的建立与鉴定目的：制备神经细胞OGD模型，为细胞信号转导机制研究奠定基础。方法：利用PC12细胞，经NGF刺激诱导向神经细胞分化，利用氧糖剥夺建立神经细胞氧糖剥夺模型；利用MTT法、Real time-PCR、Western blot和免疫荧光染色法鉴定PC12细胞转化为神经元样细胞及氧糖剥夺模型的建立。结果：应用终浓度50ng/ml NGF的DMEM完全培养基培养PC12细胞，随培养时间的增加细胞呈典型的神经元形态。MAP2免疫荧光细胞化学染色呈强阳性；随培养时间增加MAP2的表达逐渐增强，与NGF培养时间呈正相关性，建立氧糖剥夺（OGD）培养环境，OGD后神经元出现不同程度的损伤、坏死及凋亡，随OGD时间延长存活率逐渐降低、凋亡率升高。OGD可以有效的诱导HSP70的表达。结论：NGF可以有效地诱导PC12细胞转化为神经细胞；成功建立神经细胞的氧糖剥夺模型，重复性较高。2. PC12细胞OGD后Notch信号转导通路的表达变化目的：观察氧糖剥夺后PC12细胞Notch信号转导通路的表达变化。方法：利用Real time-PCR、Western blot技术分别在mRNA水平及蛋白水平检测在OGD细胞模型中Notch1、Hes1和Hes5的表达。结果：OGD后Notch1、Hes1和Hes5表达显著上调，且各时间点均高于对照组，OGD3h后，此三种基因表达水平最高，后随时间延长逐渐下降。结论： OGD可以上调Notch信号转导通路的重要位点Notch1、 Hes1及Hes5mRNA及蛋白水平，并随OGD时间延长呈动态变化；OGD能激活Notch信号转导通路。3.阻断Notch通路对PC12细胞OGD损伤及凋亡的影响目的：观察Notch通路对PC12细胞OGD损伤及凋亡的影响。方法：利用MTT法、流式细胞仪、Real time-PCR、Western blot和Hoechst免疫荧光染色观察Notch信号转导通路阻断剂对PC12细胞OGD损伤和凋亡的影响。结果： Notch通路激活剂可以有效的上调Notch1mRNA的表达，增加Notch1蛋白的表达；Notch信号通路阻断剂可以有效的抑制Notch1mRNA和蛋白的表达。Notch阻断剂组与PC12OGD3h组相比细胞存活率有所上升；Notch激活剂组与PC12OGD3h组相比细胞存活率有所下降。Hoechst染色Notch通路激活剂组可见凋亡细胞较OGD3h组增多，染色质分布不均，核固缩、核浓染；Notch通路阻断剂组可见凋亡细胞减少，核膜完整，核呈椭圆形，染色质分布均匀。结论： Notch信号转导通路激活剂可以有效的激活Notch信号转导通路；Notch信号转导通路阻断剂可以有效的抑制Notch信号转导通路的激活；Notch信号转导通路在脑缺血损伤过程中调控细胞凋亡时起负面作用。4.阻断Notch信号转导通路对PC12细胞OGD损伤保护机制的研究目的：探讨Notch信号传导通路对PC12细胞OGD损伤的作用机制。方法：利用Real time-PCR、Western blot技术观察阻断Notch信号传导通路Bcl-2、Bax的表达。结果：阻断Notch信号传导通路，OGD3h细胞Bcl-2mRNA和蛋白表达明显下降；Bax mRNA和蛋白表达明显升高；Bcl-2/Bax比值减低。结论：缺血性脑损伤早期可以激活Notch信号传导通路，对细胞凋亡的调控起负面作用，其机制可能与下调细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，上调促细胞凋亡蛋白Bax的表达有关。