论文部分内容阅读
马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)是马铃薯上的毁灭性害虫,也是我国对外重大检疫对象和重要外来入侵物种之一。γ-氨基丁酸受体(γ-aminobutyric acid receptors,GABAR)是一类配体门控离子通道型受体,是脊椎动物和非脊椎动物的中枢神经系统内最主要的抑制性神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的受体。本文基于马铃薯甲虫转录组和基因组数据库获得6条GABA受体基因cDNA全长;利用qRT-PCR的方法检测马铃薯甲虫4龄幼虫和成虫6条GABA受体基因对氟虫腈的响应;分别构建dsRNA表达载体,用喂食dsRNA干扰技术探究6条GABA受体基因的具体功能。研究结果如下。1、马铃薯甲虫GABA受体基因的克隆、序列比对和进化分析基于马铃薯甲虫转录组和基因组数据库,获得6条GABA受体基因片段。6条受体基因分为离子型GABA-A和代谢型GABA-B。A型包括Ld8916(半胱氨酸配体门控离子通道亚型8916)、LdGRD(甘氨酸(类似物)受体)、LdGluCl(谷-氨酸门控氯离子通道)和LdLCCH3(配体门控氯离子通道同系物3);B型包括LdGABA-B1和LdGABA-B2。采用RT-PCR补全片段中间的缺失并验证其正确性;通过RACE技术,得到6条基因的cDNA全长。对这6条GABA受体基因进行比对分析发现,它们具有离子型GABAA受体特有的结构域,其中Ld8916、LdGRD、LdGluCl和LdLCCH3四条受体具有离子型受体的结构域,每个亚单位包含1个大的N末端半胱氨酸的胞外区、4个紧密排列的疏水跨膜区(TM1-TM4)及1个短的胞外C端。LdGABA-B1和LdGABA-B2具有代谢型GABAB受体特有的结构域,拥有7个跨膜区。进化分析表明,这6条GABA受体与其他物种相对应的受体聚类,具有很高的保守型。2、马铃薯甲虫GABA受体基因的时空表达以及对氟虫腈的响应分析了 GABA受体基因在不同组织内的表达量,发现主要在马铃薯甲虫的脑和腹神经索中高表达,与目前有研究的其他昆虫中GABA受体基因表达部位相一致。用亚致死剂量氟虫腈(LD50=0.004微克/头)分别在4龄幼虫蜕皮后0 h和60 h进行处理,处理后每隔12 h收样,利用qRT-PCR的方法检测6条GABA受体基因的相对表达量。发现在0h处理后,除了LdGluCl,其余5条GABA受体的表达量均在12 h-84h显著下降;在60 h处理,24h后6条GABA受体基因的表达量均显著升高。用同样方法分别处理羽化0天的雌雄成虫,定量结果表明,经氟虫腈处理后,6条GABA受体基因在成虫体内的表达量都显著升高。综上所述,在幼虫和成虫中,6条GABA受体基因对氟虫腈的响应不同,并且雌雄个体间的响应程度也有所差异。3、RNAi技术分析马铃薯甲虫GABA受体基因的功能表达GABA受体基因dsRNA的菌液浸湿马铃薯叶片,并饲喂四龄初幼虫。连续喂食三天后,观测其对生长发育的影响。发现喂食第3天后,6条GABA受体基因的表达水平都显著下调。喂食dsLd8916,dsLdGluCl和dsLdLCCH3的试虫存活率显著下降,喂食其他受体基因dsRNA后对其存活率影响不大。喂食dsLd8916和dsLdGluCl的试虫化蛹率显著性下降,不能化蛹的个体主要以幼虫或者异常的蛹状态存在,最终死亡。综合以上结果表明,GABA受体基因在马铃薯甲虫幼虫生长发育和变态过程中具有重要作用,并且功能各不相同。