研究背景马尔尼菲青霉菌(Penicillium marneffei,PM)是一种温度依赖性双相型条件致病真菌,可感染免疫缺陷人群,区域流行于东南亚地区和我国南方。近年来,随着HIV患者的增加,导致全球范围内马尔尼菲青霉菌病患病率大幅度升高,已经严重影响到人类健康,但其双相转换和致病性分子机制尚不清楚。实时荧光定量PCR是马尔尼菲青霉菌双相转换和致病性分子机制研究的重要手段,但是仍缺乏用于马尔尼菲青霉菌实时荧光定量PCR标准化分析的理想的内参基因。本研究根据转录组测序数据筛选了四个表达最稳定的基因Pfp;Rpl23;FacpA;DigA与传统的内参基因18SrRNA;β-actin(Act1); β-tubulin(Btu)作为候选内参基因,用BestKeeper和geNorm软件对其进行基因表达稳定性分析,以期获得理想的内参基因。近年来,普遍认为马尔尼菲青霉菌致病的分子机制与其双相转变过程密切相关。对马尔尼菲青霉菌双相转换过程中4个不同生长时期的菌株进行链特异性转录组测序和比较分析,筛选出在双相转换过程中差异表达明显的基因,如AmyR和ctf1β。因此推测这两个基因调控双相转换过程并且参与致病过程。根据转录组测序的注释,发现AmyR和ctf1β是C6转录因子基因,分别调控菌株水解淀粉的过程和降解角质的功能。通过研究这两个转录因子基因的功能,可能会对发掘马尔尼菲青霉菌的分子致病机制提供重要线索。目的：1在筛选出理想内参基因的前提下,将qRT-PCR的精确标准化分析充分应用于双相转换和致病分子机制研究；2通过对双相转换过程中差异表达转录因子基因AmyR和ctf1β的功能初步研究,为揭示分子致病机制提供线索。方法：1根据转录组测序结果筛选出稳定表达的基因并且选取常用内参基因作为候选内参基因,对其Ct值进行一系列软件分析筛选出理想内参基因；2利用同源重组分子生物学等方法,建立目的基因敲除突变株,与初始菌株进行对比研究,初步解析基因功能。结果：1 FacpA和DigA基因在马尔尼菲青霉菌双相转换过程中表达最为稳定,可作为内参基因用于马尔尼菲青霉菌实时荧光定量PCR标准化分析；2成功构建AmyR和ctf1β基因敲除菌株,在细胞实验、药敏实验和压力应激实验中发现,对照菌株和基因突变菌株在巨噬细胞吞噬、药物敏感性以及对抗压力方面存在明显差异,AmyR基因确实参与菌株水解淀粉过程。讨论：实时荧光定量PCR是马尔尼菲青霉菌双相转换和致病性分子机制研究的重要手段,在不同的实验室中,研究者会选择不同的内参基因作为衡量标准。因此有必要在马尔尼菲青霉菌中筛选鉴定出一套更理想的内参基因用于qRT-PCR标准化分析,本研究筛选出FacpA和DigA基因可作为内参基因用于马尔尼菲青霉菌实时荧光定量PCR标准化分析。转录因子基因功能的初步研究主要包括：转录因子基因敲除前后其相关基因表达量的变化；基因敲除株的形态学变化；巨噬细胞吞噬以及在巨噬细胞内寄生的生长形态变化；药物敏感性变化和△AmyR菌株水解淀粉能力的改变进行研究。上述所得结果可以初步解析转录因子基因功能,将为双相型真菌形态转换、分子致病机制等研究奠定基础。