运动疲劳相关血清差异蛋白筛选及糖蛋白分离、富集和检测研究

来源 :陕西师范大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:denggaoangyuan
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随着人类基因组研究计划的实施与推进,生命科学的研究已经进入了后基因组时代。这个时期,生命科学的主要研究对象主要包括结构基因组研究和蛋白质组研究等,属于功能基因组学。蛋白质组是研究与基因组相对应的蛋白质组的学科。蛋白质组学重点研究作为一个大系统或部分网络组成的多个不同蛋白质的相互作用,是研究多蛋白质系统。运动性疲劳是一种非特异性的复杂的生理现象,关于对运动性疲劳的产生机理和消除方法一直备受各国专家学者关注,但是有关运动性疲劳程度的判断研究不多。研究人员主要通过测定与应激应答、炎症因子和代谢物的变化有关的生物指标,如皮质醇、睾酮、血糖、糖原、血乳酸、血尿素氮等物质的含量,来反映机体疲劳程度。但是,在运动性疲劳发生的过程中,涉及的代谢物反应复杂,种类繁多,运动类型、时间和强度都可能会对其产生一定影响,而且长时间运动引起疲劳时,蛋白质供能比例增加,造成骨骼肌不同程度的损伤,推测通过了解蛋白质代谢的变化一定能检测与判断疲劳发生的程度。本论文首先利用双向电泳联合质谱分析技术,通过对正常状态及运动疲劳状态下个体间的血浆蛋白质组比较分析,最终鉴定出12种表达量差异性蛋白,其中运动疲劳后表达上调的蛋白和表达下调的蛋白各为6种。表达下调的蛋白有α1-B-糖蛋白、丛生蛋白、免疫球蛋白α1链C结构域、血管紧张素原、补体C4-A和结合珠蛋白;表达上调的蛋白有α2-HS-糖蛋白、抗凝血酶-Ⅲ、血清白蛋白、CD5抗原、结合珠蛋白相关蛋白、载脂蛋白E。这些表达差异的蛋白质涉及到急性相蛋白、免疫相关蛋白、脂代谢相关蛋白和神经调节相关蛋白。然而,蛋白质是生物体功能的主要执行者,蛋白质的糖基化即糖链修饰是蛋白质翻译后的重要修饰之一,细胞50%以上的蛋白质具有糖链。糖蛋白的糖链在细胞表面就像细胞的天线和触角,执行着重要功能。近年来,随着蛋白质组学(Protcomics)的快速发展,糖蛋白质组学也应运而生,并逐渐为生命科学和分析化学研究领域中又一个新的前沿和热点。但是,生物机体内,由于糖蛋白的绝对丰度低,高丰度非糖蛋白质的存在对其就会产生夹带、包覆以至掩盖的作用,使大多糖蛋白难以在医药、生命科学和运动人体科学等领域被广范应用。所以如何除去高丰度非糖蛋白质,发现并分离富集低丰度的糖蛋白,已成为当前糖蛋白质组学研究的重要问题之一。因此,本论文又以体育、生物、化学、材料科学等学科交叉融汇为背景,探索了硼酸功能化修饰的不同材料对糖肽或糖蛋白的分离和富集方法的研究,并且尝试建立了以量子点为荧光探针的检测糖蛋白的方法。这些研究为糖蛋白在生物科学、医学领域和运动人体科学等研究领域的应用提供了一定的参考价值。首先利用超声法在磁性微球表面首先包覆SiO2,合成SiO2@Fe3O4微球,比传统机械搅拌法更省时省力。然后在SiO2@Fe3O4微球表面接枝三氨基苯硼酸成功合成了苯硼酸功能化的SiO2-APBA@Fe3O4微球。利用此微球表面苯硼酸基团和糖蛋白在不同酸碱性条件下可逆的亲和作用,对糖蛋白/糖肽进行选择性富集。结果显示,SiO2-APBA@Fe3O4微球对糖蛋白/糖肽具有明显的选择性富集作用,并且具有很高的吸附能力和吸附效率。提示其具有从复杂生物样本中分离富集糖蛋白/糖肽的潜在作用。其次,成功合成了苯硼酸功能化的PGMA/EDMA微球APBA@PGMA/EDMA,并且建立了以APBA@PGMA/EDMA微球为固定相的富集糖蛋白或糖基化肽的固相萃取方法。研究结果表明,APBA@PGMA/EDMA微球对糖蛋白/糖肽具有明显的吸附选择性和较高的吸附效率。此外,APBA@PGMA/EDMA微球为固定相的固相萃取方法还可以从人血清样本中不仅能分离N-连接糖基化肽,同时还能O-连接糖基化肽,表明该方法具有从复杂生物样本中捕捉糖蛋白的潜在应用价值。最后,建立了一种基于QDs的糖蛋白检测的新方法,为促进QDs荧光探针在生物分析中的应用提供了一种新思路。但是针对具体的糖蛋白的高灵敏度的检测,还需要进一步研究。
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