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对复杂蛋白质体系的分离分析已经超出了一维分离技术的能力。鉴于传统的蛋白质组分离技术2D-PAGE存在的固有缺陷,发展新型快速、高通量、规模化的多维蛋白质分离分析技术已成为加快蛋白质组学研究的关键。多维立体分离中,接口技术是提高系统性能的瓶颈。本论文立足于发展新型高效多维毛细管电泳接口及相关技术,以分离复杂蛋白质样品为目标,构建连续切换的二维毛细管电泳蛋白质分离技术平台。
微透析中空纤维薄膜可以用作二维CE接口。本文设计了一简便、快速、规格可随意调整的中空纤维薄膜制备装置,并成功制备出与分离柱管匹配、可作为二维毛细管电泳接口的中空纤维薄膜。基于2D-PAGE的分离原理,以这种中空纤维薄膜接口构建了毛细管等电聚焦-毛细管无胶筛分电泳二维(2D-CIEF-CNGSE)蛋白质分离平台,并用于对血红蛋白变体混合物和小鼠肺癌细胞分泌蛋白实际样品进行快速分离。2D-CIEF-CNGSE无论是分辨率、柱效还是峰容量都优越于各自一维的分离模式;与2D-PAGE相比,二维立体分离系统具有快速、高效等优点。
2D-CE对接口的要求很高,为了实现二维分离毛细管无额外死体积连接,设计并制作了柱上原位蚀刻的多孔膜接口,以此为核心构建了毛细管等电聚焦-毛细管区带电泳二维(2D-CIEF-CZE)蛋白质分离平台。零死体积接口保证了柱系统的高效分离性能、高分辨率、高峰容量,柱上原位多孔膜接口是不同模式毛细管分离柱连接技术的一大突破,可以将柱外死体积控制在极小的水平,尤其适合于基于毛细管电泳的二维及多维联用系统。
CIEF是2D-CE中第一维分离的首选分离模式。经由第一维分离的样品进一步向第二维分离系统中的传输是一项非常关键的技术,直接影响到分离的总体效果。以蚀刻的多孔膜接口为核心,采用毛细管作为电渗柱设计了一种微型电渗泵(EOP),通过控制电压调节泵的输出流量,可便利地达到调节聚焦区带迁移速度的效果。将所构建的EOP装置分别用于对蛋白质混合物和实际样品鹿茸提取物的CIEF区带迁移,取得较为满意的效果,对比EOP驱动法与高差驱动法证明了EOP驱动方式的可行性和实用性。