【摘 要】
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本文以酰胺基因proA为对象,在对其酶学特性及降解功能验证的基础上进一步研究了其实际应用。酰胺基因proA由之前实验室从对乙酰氨基酚降解菌shinella sp.HZA2中克隆获得。验证
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本文以酰胺基因proA为对象,在对其酶学特性及降解功能验证的基础上进一步研究了其实际应用。酰胺基因proA由之前实验室从对乙酰氨基酚降解菌shinella sp.HZA2中克隆获得。验证结果表明proA的G+C含量为68.33%,编码481-aa蛋白,分子量为50.066kDa,等电点为6.185。其编码的蛋白酶属于酰胺酶家族,与报道的其他酰胺酶显示出较低的同源性(27-34%)。蛋白酶疏水性和酶结构的预测对了解蛋白酶功能有重要的意义,研究结果显示该酰胺酶为亲水性蛋白酶,碱基组成为204A,495C,493G,254T;百分比为14.1%A,34.2%C,34.1%G,17.6%T。通过对酰胺酶ProA的的二级结构预测可知该酶主要以α-螺旋,无规则卷曲和延伸链为主,进一步利用I-TASSER成功预测了ProA的空间结构和酶活性位点。研究表明ProA的最佳反应温度为35℃,在25-45℃之间都有较强的活性。最适反应pH值为8.0,在pH7.0-9.0范围内,该酶比较稳定;Cu2+、Ag+、Cd2+、Fe3+会强烈抑制酶的活性,而Mn2+、Ca2+、Al3+、Zn2+、Mg2+对该酶没有明显的抑制作用。 选取含酰胺键的酰胺类除草剂敌稗、敌草隆、吡嘧磺隆、炔苯酰草胺和吡氟酰草胺以及乙酰苯胺用于验证ProA的功能。研究结果表明,proA编码的蛋白酶可以高效水解敌稗分子中的酰胺键,以大肠杆菌作为受体菌合成的工程菌在两个小时内将敌稗完全降解,产物为3,4-二氯苯胺;蛋白酶ProA也可以使乙酰苯胺和敌草隆的酰胺键发生断裂,纯化的酰胺酶可以在20分钟内将乙酰苯胺降解完全;对敌草隆的降解活性不是很理想,1小时的降解率大约为40%,而且酰胺酶会逐渐失去降解活性。对于吡嘧磺隆、炔苯酰草胺基本没有降解活性。
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