新疆特殊生物功能基因克隆及应用研究随着人类基因组计划和其它模式生物如拟南芥、水稻等基因组计划的完成和人们对基因认识的不断深入，基于同源序列克隆候选基因的方法成为了一条快捷克隆基因家族成员的新途径。土壤盐分是制约作物产量的主要因素，它可使作物尤其是灌溉农业的作物减产。土壤盐分过高还可造成盐碱地，限制土壤的利用。目前，世界耕种土地的大约20%和接近一半的灌溉土地都遭到了盐胁迫的危害。随着分子遗传学和植物转基因技术的发展，采用生物技术提高作物的耐盐性，使作物在盐胁迫环境中能正常生长并提高作物的产量，正受到越来越多的关注并取得了一定的成果。NHX1是液泡膜中的一种Na+/H+反向运输体，可促进钠离子在液泡中的区隔化效应，跨液泡膜的pH为其提供能量。钠离子和氯离子区隔化在液泡中，不仅可作为有效的渗透调节剂，还可减小细胞毒性，从而提高植物的耐盐能力。本研究以同源序列克隆候选基因的方法主要开展新疆野生耐盐碱植物犁苞滨藜NHX1基因的克隆、盐角草雄性不育基因orf25基因的克隆、大肠杆菌nhaA和nhaB基因的克隆、拟南芥AtNHX2 基因启动子的克隆、表达模式分析及其分子检测的研究。研究工作首先根据GenBank上已发表的各种物种的NHX1基因序列，分析其保守性并根据保守区设计了7条引物（上游4条，下游3条），分别组合经RT-PCR扩增出新疆野生耐盐碱植物犁苞滨藜NHX1基因的核心片段，连接上pMD18-T载体，经DNA序列测定后，结果与GenBank中NHX1基因序列进行同源性比较，确定已克隆出的核心片段为NHX1基因的核心片段。根据已获得的核心序列设计3`-RACE和5`-RACE引物，扩增出NHX1基因的3`末端和5`末端，拼出全长序列。根据已拼接出的NHX1全长cDNA序列设计基因特异性引物，利用RT-PCR方法扩增NHX1全长cDNA。将扩增产物连接到pMD18-T载<WP=5>体上并进行测序。序列分析表明已克隆出AdNHX1全长cDNA，已在GeneBank注册为新基因（基因注册号为：AY211397）。将其与AtNHX1进行同源性比较后，发现氨基酸具有很大差别，其后续研究可能有助于阐明耐盐植物和甜土植物耐盐能力的不同。从而为解决我国新疆地区大面积的盐碱荒地提供可行的办法。根据已发表的orf25基因、nhaA基因和nhaB基因设计基因特异性引物，采用RT-PCR或PCR的方法扩增相应的基因片段，序列分析显示所克隆的基因均含有完整的编码框，分别是orf25基因、nhaA基因和nhaB基因。为了检测AtNHX2 启动子是否受盐胁迫诱导，根据拟南芥的基因组DNA序列，设计一对引物扩增AtNHX2基因起始密码子ATG上游一段约2800bp的片段，序列分析显示克隆的片段与发表的一致。将该片段构建到植物表达载体pCAMBIA1301-1中，序列分析显示重组质粒构建正确。通过基因枪轰击洋葱表皮瞬时表达进行初步检测，检测结果说明该启动子具有活性。pCAMBIA1301-1/ AtNHX2 promoter重组质粒通过Floral dip method转染拟南芥，收获种子，筛选具有抗性的转基因植株，收获T1代转基因种子。T1代种子萌发后采用GUS染色的方法初步鉴定转基因是否成功，然后采用PCR扩增技术进一步验证。T2代转基因植株GUS表达分析显示，AtNHX2 在所有的组织中均有表达。在保卫细胞中检测到了强烈的GUS表达，这一结果表明AtNHX2 对特殊细胞的pH调控和K+自身稳定方面起着重要的作用。AtNHX2 启动子的活性可被NaCl和ABA调控，说明盐和ABA是在转录水平上调控AtNHX2的表达的。在老叶中GUS活性比在新叶中GUS活性强，这说明了AtNHX2在耐盐方面的作用。在根毛细胞中也观测到了强烈的GUS活性，这就暗示了AtNHX2 在扩大的液泡中储存Na+。这为利用该基因提高植物耐盐水平，改良农作物品种奠定了坚实的基础。