研究背景：胃癌(gastric cancer)是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一。流行病学调查表明,全球每年胃癌新发病例约为80万例,占所有新发癌症的9%,仅次于肺癌、乳腺癌及肠癌,位列第四。每年有60余万人死于胃癌,居癌症死因的第二位。胃癌主要分布在东亚、东欧及中非和南非的部分地区,我国是胃癌重点高发地区,大约有42%的胃癌病例发生在中国。在我国每年新发的40万例胃癌患者中,近30万患者在确诊后死亡,5年生存率一般低于25%。复发和转移常常是胃癌患者的主要死亡原因,因此识别胃癌发生发展过程中的关键分子将有利于胃癌的预防和治疗,降低胃癌发病率和死亡率。MicroRNA (miRNA)是一类新发现的由18-24个核苷酸组成的具有基因调控功能的单链小RNA,广泛存在于真核生物中。miRNA通常与靶基因RNA的3’非翻译区(3’-untranslated region,3’-UTR)结合通过降解或抑制转录后翻译进而实现其对靶基因的调控功能。研究表明,miRNA存在于各种重要生物进程中,而miRNA表达异常与包括肿瘤在内的多种疾病发生发展密切相关。本实验室前期研究中已针对5对进展期胃癌组织及相应癌旁正常组织进行了miRNAs差异性筛选,结果表明,miR-1246、miR-29c、miR-148a、miR-107及miR-103的表达量在胃癌与癌旁组织间存在显著性差异(P<0.05),其中miR-1246、miR-107及miR-103在胃癌组织中显著上调,而nniR-29c 及miR-148a则显著下调。DNA甲基化(DNA methylation)是表观遗传学的重要调控机制,是哺乳动物基因组发生的后天性修饰,主要发生于基因启动子区的CpG岛,参与许多重要的生物学过程,如发育、X染色体失活(X chromosomal inactivation)、印迹(imprinting)等。DNA甲基化异常可导致基因表达异常,与恶性肿瘤等许多疾病密切相关,如启动子区高甲基化所致的肿瘤抑制基因失活(tumor suppressor gene),或启动子区低甲基化所致的癌基因(oncogene)激活。近年来研究表明,对于部分具有独立启动活性的miRNAs而言,其启动子区也存在受甲基化调控的CpG岛结构。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)是指基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列改变,包括单碱基的转换、颠换、插入或缺失等表现形式,是人类最常见的一种遗传变异(genetic variation),是人种之间、个体之间差异的重要遗传物质基础,包括对恶性肿瘤等复杂疾病的易感性差异。1997年Collins等提出的“常见疾病,常见变异(common disease, common variant, CD-CV) "假说已得到学术界的广泛认同,该假说认为,常见疾病的易感性是由于人群中某些位点,特别是在基因编码区或调控区的常见变异引起的。因此在某一恶性肿瘤人群和正常对照人群中进行SNPs的对比研究,可以确定SNP位点和／或其邻近变异与肿瘤发病风险的关系,从而可应用于肿瘤遗传易感性(genetic susceptibility)的研究。近年来,针对前体nniRNAs (precursor miRNAs, pre-miRNAs)和初级miRNA (primary miRNA, pri-miRNA)相关的SNPs研究逐渐成为热点。诸多研究表明,pre-和pri-miRNAs中SNPs的存在可导致miRNAs表达量及功能的改变,而这种改变又会影响肿瘤的遗传易感性。因此,寻找具有功能学效应的SNPs位点不仅可为进一步揭示肿瘤发病机制提供理论依据,也能为临床预测肿瘤发生及预后提供重要的生物标志物,并且可为今后肿瘤的个体化预防、干预、诊断和治疗提供重要参考。研究目的：本研究基于我们前期胃癌miRNA表达谱分析结果,选择miR-29c、miR-148a和miR-107为候选miRNAs,深入探讨miR-29c、miR-148a、miR-107之间复杂的调控机制,深入揭示miR-29c在胃癌发生发展过程中的作用及其可能的分子机制,并分析miR-29c基因启动子区遗传变异与中国人群胃癌发病风险及生存预后之间的关联性,为进一步揭示表观遗传学在胃癌发生发展及预后中的作用及其分子机制提供理论依据,并为今后胃癌的预防、干预、治疗等提供重要线索。方法及结果：基于我们前期胃癌miRNA表达谱分析结果,本研究中采用亚硫酸盐修饰、real-time PCR、Western blot、流式细胞、Transwell、细胞划痕实验、CCK8及平板克隆形成实验等技术,探讨了miR-29c对miR-148a及miR-107的调控作用及其可能分子机制。结果发现,在胃癌细胞中,miR-29c通过影响甲基化转移酶DNMT-3B的表达量,进而正向调控了miR-148a的表达；而miR-29c通过结合miRNA特异性转录蛋白XP05的3’-UTR区,影响XPO5转录活性从而影响pre-miR-107的出核,最终负向调控miR-107的表达。同时我们发现,]miR-29c对于胃癌细胞的迁移及侵袭的影响可能与miR-148a有关。此外,我们通过荧光素酶报告质粒、EMSA、ChIP等技术,发现并证实了miR-29c上游存在一个具有潜在增强作用的SNP rs2724377位点。其不同等位基因与转录因子CREB的亲和性存在差异,影响了miR-29c的表达,携带CT/CC基因型的个体miR-29c表达明显高于携带TT基因型的个体。在随后的两阶段病例-对照研究中也同样证实了该SNP位点与胃癌遗传易感存在关联性,其中携带CT/CC基因型的个体发生胃癌的风险明显低于携带TT基因的个体(调整OR=0.82,95%CI=0.73-0.93),但未观察到该位点与胃癌的预后存在显著相关性。综上所述,本研究发现位于miR-29c基因启动子区的SNP rs2724377影响了转录因子CREB与DNA序列结合的亲和性(affinity),进而影响了miR-29c的表达。同时,miR-29c表达的改变,在通过调控靶基因XPO5最终上调miR-107等无CpG岛结构的miRNAs的同时,通过改变靶基因DNMT-3B表达而下调了存在CpG岛结构的miR-148a,继而影响多个生物学通路的生物功能,参与调控胃癌细胞增殖、侵袭与迁移能力,最终影响个体对胃癌的遗传易感性。本研究结果提示,miR-29c参与了胃癌发生发展的表观遗传调控,其启动子区存在的多态变异rs2724377与胃癌发生风险有关,可作为中国人群胃癌发生发展的潜在生物学标志应用于胃癌的预防、干预及临床治疗。