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为了初步探索AMPK是否参与产蛋鸡肝脏胆固醇代谢的调节,本研究通过体外悬浮培养产蛋鸡肝细胞,研究AMPK活性变化对肝细胞胆固醇合成、HMGR活性以及VLDLy合成和转运的影响,从而明确AMPK与产蛋鸡肝脏胆固醇合成和转运的关系。研究包括两个试验。 试验一、产蛋鸡肝细胞的分离和最佳灌注时间的确定 本试验在选用半原位二步胶原酶灌注法的基础上做了简化,简化之处就是剥离产蛋鸡肝门静脉,直接从肝门入口处用注射器灌注。最佳灌注时间的确定采用单因子设计,设三个处理,分别灌注40 min、30min和20min。测定肝细胞产量和细胞成活率。结果显示: 用简化肝细胞灌注法灌注40 min组,分离的细胞总数达到3.1×10~9个,细胞成活率为83.6%;灌注30min组,细胞总数降低至1.1×10~9个,细胞成活率增加到88.6%;只灌注20min时,细胞总数最低,为0.61×10~9个,但是细胞活率最高,达89.0%。在光学显微镜下观察细胞形态正常,细胞以单个、多个聚集在基础悬浮液,细胞晶莹透亮,可见细胞核,死细胞呈蓝色。 由本实验可知,简化产蛋鸡肝细胞灌注法可以得到理想的分离效果,灌注30min不仅可以得到充足的单个细胞,而且成活率满足实验要求。 试验二、AMPK活性变化对产蛋鸡肝细胞胆固醇合成的影响研究 采用单因子设计,研究AMPK活性变化对高产蛋鸡肝细胞的胆固醇合成以及合成酶活性的影响。设对照组、0.5mmol/L激活剂(AICAR)组和0.5mmol/l抑制剂(~8Br-AMP)三个组;每个组均设二个培养时间段:60min和100min,另设0min对照。以原代分离的高产蛋鸡肝细胞为材料。通过检测谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氧酶(LDH)浓度和尿酸(UA)含量来反映细胞的活力和完整性;检测AMPK活性来反映AICAR和~8Br-AMP对产蛋鸡肝细胞AMPK的调节作用;检测HMGR活性和细胞培养物TC、TG含量来反映AMPK对胆固醇合成以及合成酶的影响;检测VLDL含量和悬浮液TC、TG含量来反映VLDL的转运情况。结果显示: ①各处理ALT、LDH和UA浓度在不同的培养时间差异均不显著,说明细胞的功能和完整性在整个过程中没有受到影响,细胞的代谢能力正常; ②添加0.5mmol/L AICAR有显著活化AMPK,抑制HMGR活性的作用;培养60min时,AMPK活性升高53.0%(p<0.05),HMGR活性降低82.3%%(p<0.01),培养100min时,AMPK活性升高64.5%(p<0.01),HMGR活性降低84.8%(p<0.01);