论文部分内容阅读
帕金森病（Parkinson’s Disease,PD）是最常见的神经退行性疾病之一,主要病理特征为黑质致密部（Substantia Nigra pars compacta,SNpc）多巴胺能神经元缺失和路易小体（Lewy Bodies,LBs）形成。LBs的主要成分是聚集形式的α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）。生理状态下,α-syn通常是舒展的可溶性结构,基因突变（如A53T和E46K）、α-syn翻译后修饰（如磷酸化）、α-syn蛋白浓度升高以及环境因素（如暴露于金属离子和农药）等都可能引起α-syn聚集。Alpha-syn聚集体影响突触小泡运输,减少神经递质释放;促进钙摄取,引起线粒体功能障碍;诱发内质网应激,破坏内质网-高尔基体转运,导致细胞分泌功能障碍。更重要的是,α-syn能够被细胞释放,以单体、寡聚体、纤维体等形式被其他细胞重摄取,在α-syn脑内病理传播和PD疾病进展中起关键作用。在PD患者尸检的脑组织中,SNpc神经元的LBs内含有大量氧化还原活性的铁,提示了α-syn聚集和铁沉积之间可能存在联系。本实验室既往的工作表明,细胞内的α-syn可促进多巴胺能神经元中的铁沉积,而铁沉积可增加α-syn表达和聚集。然而,细胞间传播的α-syn对铁沉积的影响仍研究较少。我们发现了α-syn单体能够进入到细胞内,通过内质网应激引起MES23.5细胞铁调节蛋白1（Iron Regulatory Protein 1,IRP1）蛋白表达和铁调素m RNA水平升高,导致铁转出蛋白（Ferroportin,FPN）蛋白表达降低。然而,α-syn聚集体的细胞间传播对铁代谢的影响尚不清楚。本研究在原代培养的腹侧中脑（Ventral Mesencephalic,VM）神经元、原代星形胶质细胞和过表达FPN-Flag的HEK293T细胞（HEK293T-FPN-Flag细胞）中外源性加入α-syn预制原纤维（Pre-formed Fibrils,PFF）,以及在C57BL/6小鼠SN区和侧脑室注射α-syn PFF,模拟细胞间传播的α-syn PFF。应用免疫印迹法检测FPN、IRP1、重链铁蛋白、轻链铁蛋白和酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）蛋白表达的变化,应用实时荧光定量PCR检测细胞内铁调素m RNA水平的变化,应用免疫荧光法检测FPN蛋白在膜上的表达变化,应用免疫共沉淀法检测α-syn与FPN间的相互作用。在C57BL/6小鼠模型中,应用旷场、爬杆和转棒实验检测小鼠行为学变化;应用嗅觉实验检测小鼠嗅觉变化。本实验拟阐明细胞外的α-syn PFF对FPN的表达调控,并探讨其可能机制。主要研究结果如下:1.成功制备了α-syn PFF。1 mgα-syn单体溶于200μL的50 mM Tris-HCl、150 mM KCl缓冲液,37℃1000 rpm震摇7 d可制备α-syn PFF,透射电子显微镜下可见纤维体的典型丝状结构。与未超声α-syn PFF相比,1 mg/mLα-syn PFF水浴超声1 min后可观察到纤维长度变短;0.1 mg/mL和0.05 mg/mLα-syn PFF超声后基本检测不到纤维,只能观察到非晶态聚合物,且非晶态聚合物的相对量随α-syn PFF蛋白浓度的降低而增加。结果提示,水浴超声1 min可将α-syn PFF分解成短纤维,且其低浓度时进行超声处理可提高超声效率。2.原代培养的VM神经元、原代星形胶质细胞和HEK293T-FPN-Flag细胞加入1μg/mL或5μg/mLα-syn PFF处理24 h后,与相应对照组相比,原代培养的VM神经元、原代星形胶质细胞和HEK293T-FPN-Flag细胞5μg/mLα-syn PFF组FPN蛋白表达分别下降28.85%、35.64%和35.58%（P<0.05）,差异具有统计学意义;原代培养的VM神经元和HEK293T-FPN-Flag细胞1μg/mLα-syn PFF组FPN蛋白表达未发生明显变化。MES23.5细胞转染FPN-Flag质粒24 h后,α-syn表达明显上调,但FPN蛋白表达没有变化。结果提示,细胞外α-syn PFF,而不是细胞内高表达α-syn,能够诱导FPN蛋白表达降低。3.原代培养的VM神经元加入1μg/mL或5μg/mLα-syn PFF处理24 h后,与对照组相比,5μg/mLα-syn PFF组铁调素m RNA水平升高91.55%（P<0.001）,差异具有统计学意义,IRP1和重链铁蛋白蛋白表达未出现明显变化;1μg/mLα-syn PFF组铁调素m RNA水平、IRP1和重链铁蛋白蛋白表达均未出现明显变化。应用Toll样受体4（Toll-like Receptor 4,TLR4）抑制剂Resatorvid预处理原代培养的VM神经元2 h再给予5μg/mLα-syn PFF处理24 h后,Resatorvid预处理完全阻断α-syn PFF诱导的铁调素m RNA水平上调,α-syn PFF诱导的FPN蛋白表达降低仍然存在。结果提示,α-syn PFF使FPN的蛋白表达降低与铁调素和IRP1无关。4.应用内吞抑制剂Dynasore预处理原代培养的VM神经元和HEK293T-FPN-Flag细胞1 h再给予5μg/mLα-syn PFF处理24 h后,Dynasore预处理完全阻断α-syn PFF诱导的FPN蛋白表达降低。免疫荧光结果提示,在不经Triton X-100处理的HEK293T-FPN-Flag细胞中,FPN蛋白大量表达在细胞膜上;5μg/mLα-syn PFF处理24 h后,与对照组相比,FPN蛋白在膜上的表达明显下降57.50%（P<0.01）,差异具有统计学意义;Dynasore预处理HEK293T-FPN-Flag细胞1 h再给予5μg/mLα-syn PFF处理24 h后,FPN蛋白在膜上的表达显著恢复与对照组相似。结果提示,α-syn PFF诱导FPN的表达降低能够被内吞抑制剂阻断,可能与内吞过程相关。5.内吞抑制剂Dynasore预处理HEK293T-FPN-Flag细胞1 h再给予5μg/mLα-syn单体或α-syn PFF处理24 h,CO-IP检测提示,α-syn单体和α-syn PFF均可在细胞外与FPN相互作用。MES23.5细胞染Flag-α-syn质粒24 h,CO-IP检测提示,过表达的α-syn与FPN间也存在相互作用。结果提示,α-syn与FPN有相互作用。6.C57BL/6小鼠SN区注射5μgα-syn PFF 24 h后,SN区TH蛋白表达没有明显变化,提示多巴胺能神经元没有明显损伤。与对照组相比,α-syn PFF组SN区FPN蛋白表达下降26.87%（P<0.001）,差异具有统计学意义,IRP1、重链铁蛋白和轻链铁蛋白蛋白表达均未出现明显变化。7.C57BL/6小鼠侧脑室注射0.2 ngα-syn单体、2 ngα-syn单体、0.2 ngα-syn PFF和2ngα-syn PFF 7 d后,与对照组相比,2 ng PFF组在旷场中移动速度明显下降30.35%（P<0.01）,爬杆时转头和下杆所用时间分别明显增加78.29%和39.71%（P<0.05）,转棒上运动时间明显减少37.43%（P<0.001）,差异具有统计学意义;0.2 ngα-syn单体组在旷场中移动速度明显下降30.41%（P<0.01）,差异具有统计学意义,爬杆时转头和下杆所用时间以及在转棒上持续运动时间未发生明显变化;2 ngα-syn单体组爬杆时转头所用时间明显增加70.52%（P<0.05）,差异具有统计学意义,旷场中移动速度、下杆所用时间和在转棒上持续运动的时间未发生明显变化;0.2 ngα-syn PFF组旷场中移动速度、爬杆时转头和下杆所用时间以及在转棒上的持续运动时间均未发生明显变化。结果提示,侧脑室注射2 ngα-syn PFF 7 d能够导致小鼠运动行为障碍。8.C57BL/6小鼠侧脑室注射0.2 ngα-syn单体、2 ngα-syn单体、0.2 ngα-syn PFF和2ngα-syn PFF 7 d后,SN区α-syn、TH和胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP）蛋白表达均没有明显变化,提示未出现α-syn表达变化、多巴胺能神经元损伤和星形胶质细胞激活。9.C57BL/6小鼠侧脑室注射0.2 ngα-syn单体、2 ngα-syn单体、0.2 ngα-syn PFF和2ngα-syn PFF 7 d后,与对照组相比,0.2 ngα-syn PFF和2 ngα-syn PFF组SN区FPN蛋白表达分别下降26.11%和25.28%（P<0.05）,2 ngα-syn PFF组IRP1蛋白表达下降33.41%（P<0.05）,差异具有统计学意义,重链铁蛋白和轻链铁蛋白蛋白表达均未出现明显变化。10.C57BL/6小鼠侧脑室注射0.2 ngα-syn单体、2 ngα-syn单体、0.2 ngα-syn PFF和2ngα-syn PFF 7 d后,纹状体区α-syn、TH和GFAP蛋白表达均没有明显变化,提示未出现α-syn表达变化、多巴胺能神经元损伤和星形胶质细胞激活。11.C57BL/6小鼠侧脑室注射0.2 ngα-syn单体、2 ngα-syn单体、0.2 ngα-syn PFF和2ngα-syn PFF 7 d后,纹状体区FPN、IRP1、重链铁蛋白和轻链铁蛋白蛋白表达均没有明显变化。12.应用蛋白酶体抑制剂MG132预处理HEK293T-FPN-Flag细胞8 h再给予5μg/mLα-syn PFF处理2 h后,FPN的泛素化修饰水平未出现明显变化。以上结果表明,α-syn PFF处理原代培养的VM神经元、原代星形胶质细胞和HEK293T-FPN-Flag细胞24 h均可导致FPN蛋白表达下降。TLR4抑制剂Resatorvid预处理可阻断α-syn PFF引起的原代培养的VM神经元铁调素m RNA水平升高,但不能阻断FPN蛋白表达下降,且α-syn PFF并不改变原代培养的VM神经元IRP1蛋白表达,提示α-syn PFF诱导FPN蛋白表达降低可能不是通过铁调素和IRP1介导的。内吞抑制剂Dynasore预处理可阻断α-syn PFF引起的原代培养的VM神经元和HEK293TFPN-Flag细胞FPN蛋白表达下降,且在HEK293T-FPN-Flag细胞中检测到α-syn PFF可在细胞外与FPN相互作用,提示α-syn PFF可能在细胞外与FPN结合后内吞进入细胞,从而导致FPN蛋白表达降低。C57BL/6小鼠SN区注射α-syn PFF 24 h导致其SN区FPN蛋白表达降低。C57BL/6小鼠侧脑室注射α-syn PFF 7 d可引起小鼠运动功能障碍和SN区FPN蛋白表达降低。本实验借助原代培养的VM神经元、原代星形胶质细胞、HEK293T细胞和C57BL/6小鼠探讨了细胞外的α-syn PFF对FPN的表达调控及机制,研究结果将有助于明确细胞外α-syn PFF如何调控FPN蛋白表达,为研究探索α-syn聚集促进铁沉积提供了新的实验基础。