【摘 要】
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芸薹根肿病是十字花科作物土传性病害,植株一旦发病,会造成根部肿大,影响植物营养的吸收,植株生长发育缓慢,最后使得植株矮小,发育不良;严重时,根部腐烂坏死,造成整株植物死亡,死亡后其休眠孢子可长时间存活于土壤中,来年种植又会爆发此病。茎瘤芥（榨菜）作为涪陵的地标作物,在其栽培过程中受根肿病危害极为严重,对其可持续发展造成严重影响。本研究通过对根肿菌早期侵染茎瘤芥根系的形态学观察,确定根肿菌侵染及在根
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芸薹根肿病是十字花科作物土传性病害,植株一旦发病,会造成根部肿大,影响植物营养的吸收,植株生长发育缓慢,最后使得植株矮小,发育不良;严重时,根部腐烂坏死,造成整株植物死亡,死亡后其休眠孢子可长时间存活于土壤中,来年种植又会爆发此病。茎瘤芥（榨菜）作为涪陵的地标作物,在其栽培过程中受根肿病危害极为严重,对其可持续发展造成严重影响。本研究通过对根肿菌早期侵染茎瘤芥根系的形态学观察,确定根肿菌侵染及在根部定植过程的不同时期;并对根肿菌早期侵染茎瘤芥过程进行了转录组测序分析,筛选了在根肿菌侵染茎瘤芥早期的差异表达基因,从中筛选到了2个效应子基因,并对其进行了生物信息学分析,在此基础上构建过表达载体,通过与BAX共转化本氏烟草,初步验证其生物学功能;构建了2个效应子基因的原核表达载体,经IPTG诱导表达后,利用超声波破碎粗提取效应蛋白进行与榨菜根际可培养细菌互做关系分析,并接种茎瘤芥分析其对根肿病发病的影响,主要结果如下:1.利用荧光显微镜观察接种根肿菌休眠孢子后的茎瘤芥根系发现,接种后1天即可观察到根肿菌孢子吸附在茎瘤芥根系表面;3天后可观察到比根肿菌休眠孢子要大的萌发后释放的边界清晰中间透明的游动孢子,吸附在茎瘤芥根毛表面,开始侵染,为侵染的关键时期。2.转录组测序共测了6个样品,每个样品平均产出6.61 Gb数据。通过转录组测序共检测到表达的基因数为9,212,其中已知的基因为9,047个,预测的新基因为165个;共检测出5,522个新转录本,其中4,779个属于已知蛋白编码基因的新的可变剪接亚型,166个属于新的蛋白编码基因的转录本,剩下的577个属于长链非编码RNA。Phred质量分数Q30的变异范围为85.54～88.48%,平均每个样品Q30碱基均到达87.02%。3.实验以根肿菌cDNA为模板,分别扩增PBRA＿2565和6677的CDS序列,分别以SmaⅠ和BamHⅠ为限制性酶切位点,以pTFGFP为目的载体,构建PBRA＿2565-pTF-GFP和PBRA＿6677-pTF-GFP融合表达载体,两者亚细胞都定位于细胞核、细胞膜和细胞质中,两者表达后的效应蛋白PBRA＿2565和6677不具有毒力作用,不能能够直接诱导本氏烟叶片上的程序性细胞死亡的HR反应,也不具有抑制BAX诱导的HR反应。4.实验以根肿菌cDNA为模板,分别扩增PBRA＿2565和6677的CDS序列,,成功构建PBRA＿2565-pGEX-4T-1和PBRA＿6677-pGEX-4T-1载体。构建成功的载体转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,破碎后经SDS-PAGE电泳分析,PBRA＿2565目的蛋白条带与预期相符;而PBRA＿6677目的蛋白存在于沉淀当中,不可溶,为包涵体,且在37℃与25℃,诱导4 h,表达效果较好。5.将榨菜根际分离到的细菌涂布于NB平板上,接种PBRA＿2565和6677粗蛋白,4天后观察结果表明PBRA＿2565对编号为T8和T12的菌株具有抑制作用,两个菌株分别为（Fictibacillus enciensis）和Massukua sp.;PBRA＿6677的粗蛋白对编号为T2和C19的菌株具有抑制作用,两个菌株分别为巨大芽孢杆菌（Bacillus megeterium）和细菌假单胞菌（Pseudomonas baetical）。6.水培后发现,接种根肿菌接菌液和效应因子蛋白PBRA＿2565与对照组相比主根发病,根肿大情况相对较轻,侧根根系发达,整体植株相对发育较好;效应因子蛋白PBRA＿6677处理组与对照组相比主根发病,根肿大情况相差不大,侧根则相对较少,整体植株较矮;土壤培养条件下,效应蛋白PBRA＿2565和6677处理组总的肿根重比对照组总的肿根重质量大,对根肿菌无抑制作用。在石英砂培养条件下,根肿菌接种的榨菜发病程度最为严重,发病率高达78%,病情指数为58.33;接种根肿菌接和PBRA＿2566效应子粗蛋白的榨菜发病率为33%,病情指数22.22;接种根肿菌和PBRA＿6677效应子粗蛋白的榨菜发病率为22%,病情指数为19.44。
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